在白酒的釀造過程中，隨著時間推移，環(huán)境因子的改變與生物因素驅(qū)動著酒醅微生物進(jìn)行組裝與演替，微生物群落的組裝是指微生物群落從無到有或從簡單到復(fù)雜的形成過程，描述了不同微生物種群如何通過一系列生態(tài)過程（如選擇、擴(kuò)散、漂變和物種形成）在特定環(huán)境中聚集并形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)。而群落的演替是指在一定環(huán)境條件下，微生物群落的組成、結(jié)構(gòu)和功能隨時間推移而發(fā)生的有序、可預(yù)測的變化過程。微生物在組裝與演替的過程中代謝各種風(fēng)味物質(zhì)并積累。

芽孢桿菌（

Bacillus

）是濃香型白酒釀造過程中重要的功能菌屬，與酵母菌、乳桿菌以及霉菌等白酒釀造過程中的關(guān)鍵微生物聯(lián)系緊密，同時能代謝產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等多種酶，芽孢桿菌的增加或減少會影響酒醅微生物的群落結(jié)構(gòu)。微生物間的相互作用也會影響群落的組裝過程，而通過網(wǎng)絡(luò)分析可以量化微生物相互作用，進(jìn)一步分析微生物相互作用對群落組裝的影響。

四川輕化工大學(xué)食品與釀酒工程學(xué)院的曹衛(wèi)林、黃丹*和四川郎酒股份有限公司的沈毅*等從濃香型酒廠取得攤晾拌曲后的酒醅以及窖池當(dāng)中的黃水，其中黃水可以提供濃香型白酒發(fā)酵過程中的窖泥微生物，用攤晾拌曲后的酒醅和黃水構(gòu)建了濃香型白酒酒醅的多菌發(fā)酵實驗體系，同時加入從濃香型白酒酒醅分離得到的枯草芽孢桿菌（

Bacillus subtilis

JP1）進(jìn)行生物擾動實驗。通過擴(kuò)增子測序技術(shù)和生物信息統(tǒng)計學(xué)探究發(fā)酵過程酒醅微生物群落組成變化，以及枯草芽孢桿菌對酒醅微生物環(huán)境生態(tài)位寬度和相互作用的影響，以期解析枯草芽孢桿菌對酒醅微生物群落的組裝過程及演替速度的影響機(jī)制。

1 枯草芽孢桿菌對酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

1.1 枯草芽孢桿菌對酒醅微生物多樣性的影響

通過多樣性指數(shù)和主坐標(biāo)分析（PCoA）了解枯草芽孢桿菌對酒醅微 生物群落

多樣性和

多樣性的影響。發(fā)酵過程中微生物

多樣性的變化見圖1A、B，微生物豐富度用Shannon指數(shù)表示，EG和BG細(xì)菌多樣性指數(shù)有著相似的變化趨勢，均先下降后上升，在第8天時達(dá)到最低，隨后上升至23 d后趨于平穩(wěn)，枯草芽孢桿菌的 添加顯著降低了EG的細(xì)菌多樣性，這表明枯草芽孢桿菌可能對細(xì)菌的生長具有強(qiáng)烈的抑制作用；EG和BG真菌多樣性指數(shù)變化趨勢也相似，真菌多樣性指數(shù)上升至第8天后開始趨于平穩(wěn)，EG中真菌多樣性指數(shù)在整個發(fā)酵過程中總體都低于BG，說明芽孢桿菌能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，可能導(dǎo)致了微生物多樣性的降低?；贐ray-Curtis距離對EG和BG在發(fā)酵期間的微生物進(jìn)行PCoA，由圖1C、D可知，BG與EG的置信橢圓顯示酒醅微生物在發(fā)酵過程中有顯著的階段性特征（P1：0～16 d，P2：23～40 d），酒醅發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)往往具有階段性特征，且這種階段差異是由于微生物群落對外部條件的適應(yīng)而產(chǎn)生。與BG相比，真菌在EG中的階段性特征更弱，枯草芽孢桿菌改變了真菌群落的演替。另外，EG和BG發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落和真菌群落分布均有明顯的分離，ANOSIM分析表明兩組間差異顯著（

P

＜0.01）（細(xì)菌（相對強(qiáng)度

R

＝0.503 8）、真菌（

R

＝0.228 9）），說明枯草芽孢桿菌對微生物群落結(jié)構(gòu)造成了影響。這些改變這可能是酒醅微生物群落中微生物相互作用的調(diào)節(jié)，或者由于芽孢桿菌分泌各種次級代謝產(chǎn)物，從而對群落的結(jié)構(gòu)和演替造成了影響。

1.2 枯草芽孢桿菌對酒醅微生物群落組成的影響

濃香型白酒的發(fā)酵是微生物群落動態(tài)變化同時發(fā)酵的過程，對發(fā)酵過程微生物組成動態(tài)變化的了解有助于探究枯草芽孢桿菌對菌群組裝及演替的影響。采用高通量擴(kuò)增子測序技術(shù)，從酒培中獲得了1 482 203 條細(xì)菌和1 794 103 條真菌的高質(zhì)量序列，稀疏曲線表明，從酒醅獲得的序列飽和，因此確保了測序數(shù)據(jù)的充分性，其中參與發(fā)酵過程的細(xì)菌有27 門、62 綱、151 目、274 科、550 屬，真菌有7 門、23 綱、65 目、189 科、381 屬。

如圖2A所示，BG和EG中微生物組成變化相似，發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌屬有芽孢桿菌屬（

Bacillus

）、乳桿菌屬（

Lactobacillus

）、類芽孢桿菌屬（

Paenibacillus

）、醋桿菌屬（

Acetobacter

）、葡萄球菌屬（

Staphylococcus

）、棲熱菌屬（

Thermus

）、不動桿菌屬（

Acinetobacter

）等。

Lactobacillus

在發(fā)酵初期占比較大，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少，與之前研究相似，而

Paenibacillus

Acetobacter

的占比隨著發(fā)酵不斷增加。與BG相比，EG中初始細(xì)菌組成由于添加了枯草芽孢桿菌，使得Bacillus在第0天相對豐度增加，但在發(fā)酵結(jié)束時兩組的Bacillus相對豐度接近，微生物群落有一定抵抗外來物種入侵能力，同時Bacillus是濃香型白酒發(fā)酵過程中優(yōu)勢物種之一，與其他酒醅微生物在長期馴化過程中有著獨特關(guān)系網(wǎng)，實驗增加了初始Bacillus的相對含量，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行又回到了其在群落中的生態(tài)位上，執(zhí)行其功能?；诰€性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）效應(yīng)量（LDA effect size，LEfSe）分析（LDA≥2，

P

＜0.05）獲得組間具有顯著差異的細(xì)菌信息（圖2C），差異細(xì)菌有紅球菌屬（

Rhodococcus

）、黃桿菌屬（

Flavobacterium

）、氣單胞菌屬（

Aeromonas

）、普雷沃氏菌屬（

Prevotella

）等。

如圖2B所示，BG和EG中的優(yōu)勢真菌屬有未分類的曲霉屬（unclassified_f__Aspergillaceae）、曲霉屬（

Aspergillus

）、伊薩酵母屬（

Issatchenkia

）、紅曲霉屬（

Monascus

）、哈薩克斯坦酵母屬（

Kazachstania

）、復(fù)膜孢酵母屬（

Saccharomycopsis

）等，其中unclassified_f__Aspergillaceae在發(fā)酵初期占比很大，隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸減少，

Issatchenkia

Kazachstania

隨著發(fā)酵進(jìn)行豐度增加。

Aspergillus

在BG中是主要菌屬，在整個發(fā)酵過程相對豐度在30%左右，而在EG中相對豐度顯著下降（7%左右），這可能是因為枯草芽孢桿菌對

Aspergillus

產(chǎn)生拮抗作用；

Monascus

在EG后期占比增加，LEfSe分析結(jié)果（圖2D）顯示

Monascus

是EG與BG兩組的顯著差異微生物，

Monascus

Bacillus

有著代謝合作，常用于其他發(fā)酵產(chǎn)品制備。其余差異真菌屬有

Aspergillus

、有孢漢遜酵母屬（

Saccharomycodes

）、畢赤酵母屬（

Pichia

Kazachstania

等，后三者相對豐度在EG中更高。Pichia是產(chǎn)乙醇的重要貢獻(xiàn)者，其相對豐度提高，這可能會給環(huán)境因子帶來改變，影響微生物群落的組裝過程。

2 枯草芽孢桿菌對酒醅微生物群落構(gòu)建的影響

2.1 枯草芽孢桿菌對酒醅微生物群落組裝過程的影響

基于零模型（999 個隨機(jī)化）計算了β最接近的分類單元指數(shù)（βNTI），用以評估芽孢桿菌對酒醅微生物發(fā)酵過程隨機(jī)性過程和確定性過程對群落組裝機(jī)制的影響[33]。如圖3A、C所示，在發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌均受隨機(jī)性過程（|βNTI|＜2）以及確定性過程（|βNTI|＞2）影響，且主要是由隨機(jī)性過程主導(dǎo)。在βNTI基礎(chǔ)上，利用Raup-Crick指數(shù)（RCbary值）將確定性過程和隨機(jī)過程劃分為5 個生態(tài)過程并確定每個生態(tài)過程的相對重要性[34]。由圖3B、D可知，枯草芽孢桿菌影響了酒醅發(fā)酵過程中微生物群落的組裝過程。細(xì)菌群落中，同質(zhì)選擇對群落組裝的貢獻(xiàn)從19.44%增到了20.33%，異質(zhì)選擇從0.00%增加到2.77%，擴(kuò)散限制從13.88%降至4.16%，同質(zhì)擴(kuò)散從9.72%降至8.33%，生態(tài)漂移從56.94%增至63.88%。真菌群落中，同質(zhì)選擇對群落的貢獻(xiàn)從5.55%增加至22.22%，異質(zhì)選擇從9.72%降至6.94%，擴(kuò)散限制從8.33%增加至41.66%，生態(tài)漂移從76.38%降至29.16%。

這些結(jié)果表明，隨機(jī)過程在酒醅發(fā)酵過程中主導(dǎo)了微生物群落的組裝，但枯草芽孢桿菌的加入改變了異質(zhì)選擇、同質(zhì)選擇、擴(kuò)散限制、同質(zhì)擴(kuò)散和生態(tài)漂移對群落組裝的貢獻(xiàn)，導(dǎo)致了發(fā)酵過程微生物群落的分化。細(xì)菌的異質(zhì)選擇過程從0.00%增加至2.77%，真菌的同質(zhì)選擇過程貢獻(xiàn)從5.55%增加至22.22%，使酒醅微生物群落的組裝過程更具確定性。確定性過程保留了適應(yīng)性強(qiáng)的微生物，從而增強(qiáng)了某些群落特有的功能，隨機(jī)性過程可以豐富物種的功能多樣性，有助于維持生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，因此確定性過程的增加可能導(dǎo)致了群落在組裝過程中物種多樣性的降低。確定性過程是由生物因素及非生物因素共同決定，確定性過程的增加，說明枯草芽孢桿菌的加入可能導(dǎo)致環(huán)境因子及微生物相互作用發(fā)生了改變。

2.2 枯草芽孢桿菌對發(fā)酵過程中酒醅理化指標(biāo)的影響

酒醅發(fā)酵過程中理化因子的變化與微生物群落演替及代謝情況密切相關(guān)，酒醅的水分含量、乙醇含量、還原糖和總酸含量變化情況如圖4所示。其中水分含量和乙醇含量作為感官上最直觀的理化參數(shù)之一，對微生物組生長代謝具有顯著的驅(qū)動作用。BG與EG的水分含量和乙醇含量呈現(xiàn)了相似的變化趨勢，均表現(xiàn)為第0～16天快速上升，第16～40天開始下降并趨于平緩，其中發(fā)酵第16天時酒醅乙醇含量達(dá)到最大值，BG和EG組分別為（8.35±0.07）、（9.73±0.07）mL/100 g。還原糖作為微生物群落的基本營養(yǎng)物質(zhì)，在酒醅發(fā)酵中扮演著至關(guān)重要的作用。在發(fā)酵第0～8天，BG與EG的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)持續(xù)增加并達(dá)到最大，最大值分別為（8.90±0.13）%、（9.06±0.15）%，這可能是起始酒醅微生物快速分解淀粉導(dǎo)致還原糖含量上升，芽孢桿菌屬是α-葡萄糖苷酶（3.2.1.20）基因的優(yōu)勢微生物，EG中高豐度的芽孢桿菌導(dǎo)致了其擁有更高的還原糖含量。BG與EG的總酸含量在發(fā)酵第0～16天時，上升速率最快，分別為（0.45±0.03）、（0.44±0.01）mmol/10 g。在發(fā)酵第16～40天時，EG的總酸含量顯著高于BG。各理化指標(biāo)在0～23 d內(nèi)均有較大變化，在23 d后變化幅度減小。受枯草芽孢桿菌的影響，EG與BG的理化指標(biāo)有著相似的變化趨勢，但變化幅度有所不同。

2.3 枯草芽孢桿菌對酒醅微生物環(huán)境生態(tài)位寬度的影響

環(huán)境的改變會導(dǎo)致生態(tài)位重構(gòu)，這驅(qū)動了細(xì)菌或真菌群落的聚集，前面的分析指明，加入枯草芽孢桿菌后，酒醅發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)變化發(fā)生了顯著差異，為了探究這種改變對酒醅微生物的影響，通過計算物種在兩個發(fā)酵體系中的環(huán)境生態(tài)位寬度，可以了解該物種對環(huán)境資源的利用程度和適應(yīng)能力的改變。根據(jù)Jiao Shuo等的方法計算了每個物種分別在EG和BG中的環(huán)境生態(tài)位寬度，對環(huán)境生態(tài)位寬度增加或減少的物種數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計，同時為了表征群落內(nèi)部的微生物變化情況，根據(jù)微生物的相對豐度將其劃分為6 個亞群落：稀有類群、豐富類群、中間類群、條件稀有類群、條件豐富類群、條件稀有或豐富類群。

如圖5A、B所示，細(xì)菌菌群中，與BG相比，EG中大部分物種的環(huán)境生態(tài)位寬度都降低，同時降低了整個細(xì)菌群落的生態(tài)位寬度，而真菌群落中環(huán)境生態(tài)位寬度下降與上升的物種數(shù)量相當(dāng)，真菌群落整體的生態(tài)位寬度變化也不大，說明枯草芽孢桿菌對細(xì)菌菌屬的生態(tài)位寬度影響大于真菌，這種差異表明真菌群落中微生物占據(jù)更廣的生態(tài)位寬度，對環(huán)境變化具有更高的適應(yīng)能力以及抵抗能力，在環(huán)境改變后依然能更廣泛的利用資源。EG中細(xì)菌、真菌的稀有類群的數(shù)量都顯著增加，同時條件稀有類群和條件稀有或豐富類群的物種數(shù)量顯著降低，說明EG當(dāng)中微生物的生存壓力更大，導(dǎo)致一些物種相對豐度在整個發(fā)酵過程中下降甚至是消失?？莶菅挎邨U菌的添加影響了酒醅微生物的環(huán)境生態(tài)位寬度，這可能解釋了酒醅微生物多樣性的變化。

為了明確環(huán)境生態(tài)位寬度的改變對酒醅微生物亞群落組成的影響，計數(shù)EG和BG各亞群落的共有成員。如圖5C、D所示，細(xì)菌群落中EG和BG的稀有類群和條件稀有類群共有成員最多；其次在EG當(dāng)中的稀有類群和BG當(dāng)中的條件稀有類群有36 個共有成員，相比于BG，EG有21 個成員的環(huán)境生態(tài)位寬度有所下降。真菌群落中EG的稀有類群和BG的條件稀有類群共有成員最多，總共97 個，有68 個的環(huán)境生態(tài)位寬度下降。條件稀有類群相對于稀有類群，在微生物群落中擁有更高的相對豐度，EG中稀有類群與BG中條件稀有類群的高相似度，說明大多數(shù)微生物在EG當(dāng)中相對豐度下降，同時環(huán)境生態(tài)位寬度的降低，證明了微生物對環(huán)境的利用程度和范圍降低，枯草芽孢桿菌通過影響濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物的環(huán)境生態(tài)位寬度進(jìn)而導(dǎo)致稀有類群物種數(shù)的增加。而稀有類群對環(huán)境更敏感，稀有菌群與優(yōu)勢菌群的占比會影響群落對環(huán)境干擾的抵抗與恢復(fù)能力，因而可能會對酒醅發(fā)酵過程中微生物群落的演替速度與方向造成影響。

2.4 枯草芽孢桿菌對酒醅微生物群落演替速率的影響

枯草芽孢桿菌的加入影響了酒醅中微生物的生態(tài)位重構(gòu)，微生物亞群落結(jié)構(gòu)改變，同時各亞群落的環(huán)境生態(tài)位寬度改變，如圖6A～C所示，展示了酒醅微生物主要的3 個亞群落的環(huán)境生態(tài)位寬度變化，細(xì)菌中稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度顯著下降，條件稀有類群和條件稀有或豐富類群的環(huán)境生態(tài)位寬度無顯著變化；真菌中稀有類群和條件稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度顯著上升，而條件稀有或豐富類群的環(huán)境生態(tài)位寬度顯著下降。稀有類群對環(huán)境的響應(yīng)與變化，對微生物群落總體差異貢獻(xiàn)大于豐富類群，這影響了微生物群落的演替速率（圖6D、E）。酒醅發(fā)酵過程中細(xì)菌稀有類群數(shù)量及占比增加，優(yōu)勢物種（相對豐度＞1%）數(shù)減少，且稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度降低，更容易受環(huán)境影響而改變，加快了酒醅發(fā)酵過程細(xì)菌群落的演替速度。而真菌稀有物種數(shù)量增加，但相對于BG，EG中稀有類群和條件稀有類群的環(huán)境生態(tài)位寬度增加，減弱了亞群落受環(huán)境的影響，降低了真菌群落演替速度。

3 枯草芽孢桿菌酒醅微生物相互作用的影響

環(huán)境的改變推動了微生物群落的演替，同時微生物間相互作用也會推動群落的演替，為了研究芽孢桿菌對酒醅發(fā)酵過程中微生物相互作用的影響，基于Spearman相關(guān)性系數(shù)構(gòu)建了微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)（|

r

|＞0.8、

P

＜0.05）。

由圖7A、B可知，BG的微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共分為5 個模塊、211 個節(jié)點、512 條邊，網(wǎng)絡(luò)平均加權(quán)度6.029，模塊化系數(shù)0.879。EG的網(wǎng)絡(luò)共分為5 個模塊、262 個節(jié)點、1 851 條邊，網(wǎng)絡(luò)平均加權(quán)度23.816，模塊化系數(shù)0.551。EG網(wǎng)絡(luò)中的稀有類群和條件稀有類群占比增加，而豐富類群以及條件稀有或豐富類群的占比下降。EG中微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)平均加權(quán)度與邊數(shù)顯著增加，且模塊化系數(shù)降低。如圖7C、D所示，相比BG，EG網(wǎng)絡(luò)中各模塊的條件稀有類群的占比增加，且稀有類群和條件稀有類群在各模塊中分別變得均勻。稀有類群與條件稀有類群對環(huán)境變化更加敏感，兩者在各模塊中分布的增加可能推動微生物群落結(jié)構(gòu)的改變。

這些結(jié)果說明枯草芽孢桿菌增加了稀有類群的數(shù)量與種類，增強(qiáng)了稀有類群在微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的功能，同時微生物網(wǎng)絡(luò)的模塊化程度降低，微生物之間關(guān)系更復(fù)雜，微生物網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性降低，特別的，實驗組共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中最大的模塊1全是細(xì)菌，而第3大的模塊3也僅有3 個真菌屬，兩模塊分別占了網(wǎng)絡(luò)的18.70%和16.79%，芽孢桿菌的增加使得細(xì)菌群落內(nèi)部聯(lián)系更緊密，使細(xì)菌群落更不穩(wěn)定，推動了細(xì)菌群落的組裝與演替。

結(jié) 論

枯草芽孢桿菌擾動了濃香型白酒釀造過程中酒醅微生物群落的組裝過程，改變了酒醅微生物亞群落的分布與組成?？莶菅挎邨U菌的加入使乙醇、還原糖以及總酸含量增加，環(huán)境因子的改變導(dǎo)致了在發(fā)酵過程中酒醅微生物的生態(tài)位重構(gòu)差異，微生物在群落中可利用環(huán)境資源程度及環(huán)境適應(yīng)性發(fā)生改變，使酒醅微生物群落的組裝過程發(fā)生改變，細(xì)菌異質(zhì)選擇與真菌同質(zhì)選擇對群落組裝的貢獻(xiàn)增加，酒醅微生物的群落組裝過程變得更具確定性。微生物環(huán)境生態(tài)位寬度的變化改變了亞群落的數(shù)量以及其組成，而亞群落對環(huán)境的響應(yīng)不同，不同亞群落的占比影響了酒醅微生物群落的演替速度，枯草芽孢桿菌的加入加快了細(xì)菌群落的演替，而降低了真菌群落的演替速度。本研究結(jié)果揭示了枯草芽孢桿菌對濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落的構(gòu)建及群落演替的影響，對白酒釀造過程中微生物生態(tài)學(xué)研究具有重要意義。

本文《 枯草芽孢桿菌對濃香型白酒酒醅微生物群落組裝模式的影響 》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第15期164-173 頁， 作者： 曹衛(wèi)林，張亞東，向港興，蔡海燕，王超凱，羅惠波，夏 玙，黃 丹*，沈 毅* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250110-075 。 點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：林安琪；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)