三叉神經(jīng)痛（TN）小鼠模型通過單側眶下神經(jīng)慢性縮窄損傷建立。小鼠麻醉后，仰臥固定于手術墊上并暴露口腔；在左側腭頰黏膜作一長約0.5 cm的切口，經(jīng)鈍性分離顯露三叉神經(jīng)的眶下神經(jīng)分支，隨后用4.0號腸線結扎該神經(jīng)，并在結扎點遠端切除約1 mm的神經(jīng)段。

Fig1 Von Frey測試示意圖 （可根據(jù)需要結合光遺傳學等）

Von Frey測試

Von Frey測試是一種用于評估小鼠和大鼠機械性異常性疼痛的方法。

在該測試中，動物被單獨放置于底部為金屬網(wǎng)或其它可穿透材質(zhì)的小籠中。實驗者將一根單絲纖維垂直施加于后足底面，直至其彎曲，從而施加一個恒定且預先確定的力，持續(xù)2–5秒。若動物在刺激過程中或剛移除纖維后表現(xiàn)出任何傷害性防御行為，如迅速縮回足部、舔舐或甩動足部，則視為陽性反應。雖然最常測試的區(qū)域是后足底面，但也可測試身體其他部位，例如后足背側或腹部。

目前有多種方法利用手動Von Frey測試評估機械敏感性，包括“上下法”（up-down method）、“遞增刺激法”（ascending stimulus method）和“百分比反應法”（percent response method），應用最多主要是“上下法”。

“上下法”用于確定引起50%動物出現(xiàn)足部撤回反應所需的機械力，其計算基于用于確定半數(shù)致死劑量（LD50）的統(tǒng)計公式。實驗從一根預估接近50%撤回閾值的纖維開始：若無反應，則換用更高力度的下一根纖維；若有反應，則換用更低力度的纖維。如此交替進行，直到首次方向改變后至少獲得四次讀數(shù)，并記錄整個反應序列（“?”表示無反應，“+”表示有反應）。為準確計算50%閾值，通常需要圍繞估計閾值獲得至少六次反應。

50%閾值的計算公式為：

50% 閾值（克） = 10 (X + k·d) / 10?

其中：

X = 最后一次使用的Von Frey纖維的對數(shù)值（log單位）

k = 根據(jù)反應模式查表所得的系數(shù)

d = Von Frey纖維間力度增量的平均對數(shù)值（log單位）

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行為學測試方法

常用von Frey輕觸三叉神經(jīng)支配區(qū)域（如胡須墊），記錄動物因疼痛而迅速甩頭、抓臉或躲避的反應。

機械撤回閾值測試（50% withdrawal threshold）：

使用8根力度范圍為0.007–6.0 g的Von Frey纖維絲垂直施加于后足底內(nèi)側表面，直至纖維輕微彎曲。若小鼠在4秒內(nèi)迅速縮回足部，視為陽性反應。采用“上下法”（up–down method）計算50%機械撤回閾值。

在三叉神經(jīng)痛的研究中，“withdrawal frequency”（撤回頻率）通常是指實驗動物在接受面部機械或熱刺激后，快速縮回頭部、面部或胡須墊的次數(shù)或比例，用于量化其疼痛敏感性或痛覺過敏的程度。

撤回頻率測試（withdrawal frequency test）：

選用6根特定力度的纖維絲（0.07、0.16、0.4、1.0、1.4 和 6.0 g），同樣垂直施加于后足底內(nèi)側，每根纖維施加1秒，重復5次。陽性反應定義為足部對刺激的快速、即時撤回。記錄每次刺激的反應，并計算每根纖維引發(fā)撤回反應的頻率（即陽性次數(shù)/5次）。

Withdrawal frequency =（出現(xiàn)撤回反應的次數(shù)/總刺激次數(shù)）× 100%，頻率越高，說明動物對刺激越敏感，提示疼痛樣行為增強。

在三叉神經(jīng)痛模型（如慢性壓迫三叉神經(jīng)根、炎癥或神經(jīng)損傷模型）中，withdrawal frequency會顯著升高；而有效鎮(zhèn)痛藥物處理后，該頻率會下降。

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