肝細(xì)胞癌（ HCC ）的高度異質(zhì)性給臨床治療帶來挑戰(zhàn) —— 盡管靶向治療與免疫治療 的開展 ，仍有大量患者面臨耐藥或療效短暫的問題。其中，約 10% 的肝癌患者同時(shí)存在 c-MET 受體酪氨酸激酶激活與 β- 連環(huán)蛋白功能獲得性突變，這一亞型因侵襲性強(qiáng)、對(duì)現(xiàn)有治療手段響應(yīng)差，成為臨床治療中需重點(diǎn)突破的難題。此前， PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路雖被證實(shí)常在肝癌中異常激活，但該通路在 c-MET/β-catenin 聯(lián)合驅(qū)動(dòng)肝癌發(fā)生發(fā)展中的具體調(diào)控機(jī)制尚未明確，針對(duì)性治療靶點(diǎn)的缺失導(dǎo)致這類患者的治療選擇受限。

近日，一項(xiàng)發(fā)表于國際肝病領(lǐng)域期刊Hepatology的研究，為該亞型肝癌的治療提供了新方向。該研究題為Targeting mTORC2-Dependent AKT/FOXO1/RNF125 signaling exploits a therapeutic vulnerability in c-MET-activated and β-catenin-mutated hepatocellular carcinoma，由 夏威夷大學(xué)王雪擔(dān)任第一作者，西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院徐蒙副研究員、夏威夷大學(xué)陳昕教授、四川大學(xué)華西醫(yī)院王海川副研究院共同擔(dān)任通訊作者，聯(lián)合中美多所科研機(jī)構(gòu)團(tuán)隊(duì)完成。

研究團(tuán)隊(duì)首先利用 c-Met/β-cateninΔ90 小鼠模型展開研究，發(fā)現(xiàn) mTORC2/AKT 級(jí)聯(lián)反應(yīng)在該亞型肝癌病灶中持續(xù)激活。為驗(yàn)證 mTORC2 的功能，團(tuán)隊(duì)采用遺傳性敲除技術(shù)去除其關(guān)鍵亞基 Rictor ，結(jié)果顯示 c-Met/β-cateninΔ90 依賴的肝癌發(fā)生被顯著抑制，小鼠生存期延長，肝臟腫瘤負(fù)荷明顯降低，直接證實(shí) mTORC2 是維持該亞型肝癌惡性表型的核心調(diào)控因子。

在機(jī)制解析環(huán)節(jié)，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步明確了 mTORC2/AKT 的下游關(guān)鍵效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。一方面， AKT 可通過磷酸化 TSC2 ，解除其對(duì) mTORC1 的抑制作用，激活 mTORC1 通路；另一方面， AKT 能磷酸化 FOXO1 轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致其核轉(zhuǎn)位受阻而失活。為驗(yàn)證這兩個(gè)效應(yīng)軸的作用，團(tuán)隊(duì)開展了系列實(shí)驗(yàn)：在 Rictor flox /flox ;Tsc2 flox/ flox 雙敲除小鼠中，通過 高壓 尾靜脈注射 c-Met/β-cateninΔ90/Cre 質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn) TSC2 缺失介導(dǎo)的 mTORC1 持續(xù)激活可部分挽救 Rictor 敲除導(dǎo)致的腫瘤發(fā)生延遲，但無法完全逆轉(zhuǎn)，提示除 TSC2/mTORC1 軸外，存在其他關(guān)鍵下游效應(yīng)通路；而通過過表達(dá) 持續(xù)激活 形式的 FOXO1 （ FOXO1AAA ，其 T24 、 S256 、 S319 三個(gè) AKT 磷酸化位點(diǎn)突變，可抵抗 AKT 介導(dǎo)的失活），能顯著抑制 c-Met/β-cateninΔ90 小鼠的肝癌發(fā)生，同時(shí)在 HepG2 、 SNU449 、 PLC/PRF/5 三種人肝癌細(xì)胞中， FOXO1AAA 過表達(dá)可誘導(dǎo) G1 期細(xì)胞周期停滯并促進(jìn)凋亡，抑制細(xì)胞生長；反之，在 Foxo1 flox/ flox 小鼠中敲除 Foxo1 ，會(huì)加速 c-Met/β-cateninΔ90 驅(qū)動(dòng)的肝癌發(fā)展，這些結(jié)果共同證實(shí) FOXO1 在該特定肝癌亞型中發(fā)揮明確的腫瘤抑制作用。

為進(jìn)一步挖掘 FOXO1 下游的關(guān)鍵靶分子，研究團(tuán)隊(duì)通過整合分析 FOXO1AAA 過表達(dá)肝癌細(xì)胞的 RNA-seq 數(shù)據(jù)、 TCGA LIHC 數(shù)據(jù)庫中肝癌組織與正常組織的差異表達(dá)基因、患者生存相關(guān)基因及啟動(dòng)子區(qū)含 FOXO1 結(jié)合位點(diǎn)的基因，最終篩選出 RING 指結(jié)構(gòu)泛素 E3 連接酶 RNF125 。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證顯示， RNF125 是 FOXO1 的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)： ChIP -seq 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn) FOXO1 可結(jié)合 RNF125 啟動(dòng)子區(qū)域， JASPAR 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到該區(qū)域存在 FOXO1 結(jié)合基序， ChIP -PCR 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí) FOXO1 與 RNF125 啟動(dòng)子的特異性結(jié)合；在 c-Met/β-cateninΔ90 小鼠肝癌組織中 Rnf125 表達(dá)下調(diào)，而 FOXO1AAA 過表達(dá)可顯著上調(diào)人肝癌細(xì)胞中 RNF125 的 mRNA 水平。臨床樣本分析顯示， RNF125 在人類肝癌組織中表達(dá)顯著低于正常肝組織，且低表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)，其表達(dá)水平與 β-catenin 靶基因 GS 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)， RNF125 是該信號(hào)軸中的關(guān)鍵腫瘤抑制因子：在 c-Met/β-cateninΔ90 小鼠中過表達(dá) RNF125 ，可顯著抑制腫瘤發(fā)生，延長小鼠生存期；在人肝癌細(xì)胞中，過表達(dá) RNF125 可通過誘導(dǎo) G1 期細(xì)胞周期停滯和凋亡，抑制細(xì)胞增殖和集落形成。進(jìn)一步機(jī)制研究顯示， RNF125 是 FOXO1 介導(dǎo)腫瘤抑制作用的關(guān)鍵下游效應(yīng)分子：通過 siRNA 敲低 RNF125 ，可顯著逆轉(zhuǎn) FOXO1AAA 對(duì)肝癌細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)；在 c-Met/β-cateninΔ90/pT3-Foxo1AAA 小鼠模型中破壞 Rnf125 ，同樣能逆轉(zhuǎn) Foxo1AAA 的腫瘤抑制表型。 RNA-seq 和蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示， RNF125 過表達(dá)可顯著下調(diào)細(xì)胞周期、 DNA 復(fù)制及肝癌相關(guān)信號(hào)通路，其相互作用蛋白中富集了 MCM6 、 MCM9 、 M AP 3K 4 等細(xì)胞周期調(diào)控因子，且 RNF125 可通過泛素化降解 MCM9 和 MAP3K4 （而非 MCM6 ），發(fā)揮腫瘤抑制作用。

尤為重要的是，研究團(tuán)隊(duì)通過體內(nèi)多西環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)驗(yàn)證了 RNF125 的治療潛力：在已形成 c-Met/β-cateninΔ90 肝癌的小鼠中，誘導(dǎo) RNF125 表達(dá)可顯著延長小鼠生存期，短期（ 3 天）誘導(dǎo)即可抑制腫瘤生長，中期（ 12-14 天）誘導(dǎo)可使肝臟重量明顯降低，腫瘤組織中 Ki67 陽性細(xì)胞比例減少， cleaved Caspase3 陽性細(xì)胞比例增加，提示 RNF125 可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡，阻斷已形成腫瘤的進(jìn)展。

綜上，該研究完整揭示了mTORC2-AKT/FOXO1/RNF125信號(hào)軸在c-MET激活/β-catenin誘導(dǎo)的肝癌的驅(qū)動(dòng)機(jī)制：c-MET與β-catenin突變協(xié)同可激活mTORC2/AKT通路，AKT通過磷酸化TSC2和FOXO1分別激活mTORC1通路并抑制FOXO1的腫瘤抑制功能，導(dǎo)致FOXO1下游靶基因RNF125表達(dá)下調(diào)，而RNF125通過泛素化降解MCM9、MAP3K4等細(xì)胞周期調(diào)控因子，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。該研究不僅填補(bǔ)了 FOXO1 在該特定肝癌亞型中功能及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的知識(shí)空白，更將 RNF125 定位為極具潛力的治療靶點(diǎn)，為開發(fā) RNF125 激活劑或雙靶點(diǎn) mTORC1/2 抑制劑提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，有望為 c-MET/β-catenin 突變型肝癌患者帶來全新的精準(zhǔn)治療方案。

原文鏈接：doi: 10.1097/HEP.0000000000001637

制版人：十一

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