中文摘要

目的確定使用程序融解系統(tǒng)融解凍存水痘減毒活疫苗收獲液的最佳融解溫度-時間條件，并分析同一融解溫度-時間條件下，不同裝量對疫苗原液中的水痘病毒滴度的影響。

方法分別采用程序融解系統(tǒng)在不同融解溫度-時間（40 ℃-120 min、50 ℃-90 min、60 ℃-60 min）下融解不同裝量（2.5、3.5、4.5 L）的凍存疫苗收獲液，然后純化制備原液，采用噬斑法檢測原液病毒滴度，重復(fù)3次。選擇最佳的融解溫度-時間條件，并應(yīng)用于3批疫苗收獲液。

結(jié)果不同融解溫度-時間和裝量條件下融解制備的疫苗原液病毒滴度均符合4.5～6.0 lgPFU/mL的標(biāo)準(zhǔn)。基于Ⅲ類平方和的雙因素方差分析顯示，溫度-時間與裝量對疫苗原液病毒滴度的獨立主效應(yīng)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。溫度-時間的獨立主效應(yīng)尤為突出(F=31.69，P<0.001)，隨著融解溫度的升高和時間的縮短，病毒滴度顯著增加。裝量對病毒滴度的影響差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.75，P=0.006），同一融解溫度-時間條件下，隨著裝量的增加疫苗原液病毒滴度隨之下降。融解溫度-時間為60 ℃-60 min、裝量2.5 L時疫苗收獲液制備的原液病毒滴度最高，其均值±標(biāo)準(zhǔn)差為（5.23±0.06） lgPFU/mL。將最佳融解條件應(yīng)用于3批疫苗收獲液，制備的疫苗原液病毒滴度的均值±標(biāo)準(zhǔn)差為（5.27±0.03） lgPFU/mL。

結(jié)論疫苗收獲液使用程序融解系統(tǒng)的最佳融解溫度-時間條件為60 ℃-60 min。同一融解溫度-時間條件下，小裝量疫苗收獲液制備的原液病毒滴度更高。

正文

水痘-帶狀皰疹病毒（varicella zoster virus，VZV）屬于α-皰疹病毒亞家族成員，感染后可導(dǎo)致水痘，以皮膚散在水皰性病變?yōu)樘卣?。原發(fā)感染后，VZV在背根神經(jīng)節(jié)潛伏，再次激活可導(dǎo)致帶狀皰疹，以疼痛性皮膚皮疹為標(biāo)志。用VZV Oka株生產(chǎn)的水痘減毒活疫苗（水痘疫苗）是預(yù)防水痘的有效手段，具有顯著的免疫保護作用，在全球范圍內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用。

在水痘疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中，程序融解系統(tǒng)可應(yīng)用于凍存水痘疫苗收獲液的融解，融解后的收獲液通過超聲純化提取病毒制備原液。程序融解系統(tǒng)通過加熱單元、擺動融解箱與控制平臺實現(xiàn)精確溫控，自動化控制融解過程，可以提升生產(chǎn)效率與產(chǎn)品質(zhì)量一致性。研究表明，溫度是影響病毒滴度的關(guān)鍵參數(shù)，在大規(guī)模程序化融解工藝中，如何優(yōu)化資源配置，提升生產(chǎn)效率的同時最大限度地維持VZV活性，已成為當(dāng)下的研究熱點與技術(shù)難點。本研究旨在探索水痘疫苗中間品使用程序融解系統(tǒng)的最佳融解條件，探究溫度-時間對疫苗病毒滴度的影響，高效指導(dǎo)水痘疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。

1

材料與方法

1.1

細(xì)胞及毒株

人二倍體細(xì)胞MRC-5株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，VZV Oka株由日本大阪大學(xué)微生物病研究會提供。

1.2

材料與儀器

水痘疫苗收獲液，批號A1用于實驗，批號B1、B2、B3用于最佳融解條件的應(yīng)用。0.5%亞甲藍(lán)購自美國Sigma公司，水痘疫苗效價滴定工作品由上海生物制品研究所有限責(zé)任公司制備。

R-3000TS程序融解系統(tǒng)購自日本四國計測工業(yè)株式會社。

1.3

實驗條件

設(shè)定3組程序融解系統(tǒng)的溫度-時間組合條件：40 ℃-120 min，50 ℃-90 min和60 ℃-60 min，每個條件分別應(yīng)用于3種裝量（2.5、3.5和4.5 L）的凍存水痘疫苗收獲液，并確保充分融解。

1.4

實驗方法

1.4.1　收獲液融解根據(jù)1.3的實驗條件，設(shè)置程序融解系統(tǒng)溫度，將不同裝量的凍存水痘疫苗收獲液置于相應(yīng)溫度，并保持一定時間。融解完成后，經(jīng)病毒提取制備水痘疫苗原液后取樣，采用噬斑法測定病毒滴度，每組實驗重復(fù)3次。

1.4.2　病毒滴度測定將供試品按10、100、1 000 倍稀釋后，接種至鋪滿單層MRC-5 細(xì)胞的6孔板，然后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)7～10 d，培養(yǎng)結(jié)束后，棄去生長液，加入稀釋后的亞甲藍(lán)染色液，室溫放置0.5~1.5 h，棄去染色液，計算噬斑數(shù)，病毒滴度應(yīng)為4.5～6.0 lgPFU/mL。

1.4.3　應(yīng)用選取獲得的原液病毒滴度符合4.5～6.0 lgPFU/mL、且滴度最高的融解溫度-時間為最佳融解條件，然后選擇合適的裝量，應(yīng)用于3批水痘疫苗收獲液。

1.5

數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26軟件進行統(tǒng)計分析。首先進行描述性統(tǒng)計，初步探索數(shù)據(jù)特征；隨后采用基于Ⅲ類平方和的雙因素方差分析，以無偏評估溫度-時間與裝量對病毒滴度的獨立主效應(yīng)。統(tǒng)計顯著性水平設(shè)定為雙側(cè)α=0.05。效應(yīng)量通過偏η2評估：0.01≤偏η2<0.06為小效應(yīng)，0.06≤偏η2<0.14為中等效應(yīng)，偏η2≥0.14為大效應(yīng)。組間多重比較采用最小顯著差異法，為深入分析因素影響，進一步采用線性回歸分析，在此過程中通過方差膨脹因子（<5）排除多重共線性干擾，并采用標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)（β）衡量各自變量對因變量的影響方向與相對強度。所有計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2

結(jié)果

2.1

水痘疫苗原液病毒滴度

病毒滴度結(jié)果和雙因素方差分析見表1、2?；冖箢惼椒胶偷碾p因素方差分析結(jié)果顯示，溫度-時間與裝量對水痘疫苗原液病毒滴度的獨立主效應(yīng)差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。溫度-時間對病毒滴度的影響差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.69，P<0.001），且為大效應(yīng)量（偏η2= 0.779）。隨著溫度的升高及處理時間的縮短，病毒滴度顯著增加，60 ℃-60 min條件下的病毒滴度最高。裝量對病毒滴度的影響差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.75，P=0.006），效應(yīng)量為大（偏η2= 0.429），小裝量（2.5 L）條件下病毒滴度高于大裝量（4.5 L）。溫度-時間和裝量之間的交互效應(yīng)不顯著（F=0.19，P=0.942），且為小效應(yīng)量（偏η2= 0.040），表明二因素的組合對病毒滴度未表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用。

表3的回歸分析結(jié)果顯示，溫度-時間和裝量對病毒滴度有顯著影響。溫度-時間對病毒滴度的影響較大（β=0.14，P<0.05），裝量對病毒滴度有負(fù)向影響（β=-0.07，P<0.05）。溫度-時間的影響力明顯大于裝量。

2.2

應(yīng)用

選取所獲得原液的病毒滴度符合4.5～6.0 lgPFU/mL、且滴度最高的60 ℃-60 min為最佳融解條件并應(yīng)用于3批水痘疫苗收獲液。表4為60 ℃-60 min融解條件下，2.5 L裝量水痘疫苗收獲液制備的原液病毒滴度結(jié)果，符合水痘疫苗原液滴度標(biāo)準(zhǔn)4.5～6.0 lgPFU/mL。

3

在水痘疫苗的生產(chǎn)工藝中，溫度-時間是影響病毒滴度的關(guān)鍵因素，需要探索水痘疫苗中間品的最佳融解條件，以確保大規(guī)模生產(chǎn)中水痘疫苗原液的病毒活性。本研究探討了凍存水痘疫苗收獲液在不同溫度-時間融解后制備的疫苗原液的滴度變化，并考察了同一溫度-時間條件下不同裝量對病毒滴度的影響。研究表明，VZV對溫度較為敏感，高溫短時間的處理更有利于保護病毒活性，融解溫度-時間為60 ℃-60 min、裝量為2.5 L時，病毒滴度最高，為（5.23±0.06） lgPFU/mL。 通過采用Ⅲ類平方和的雙因素方差分析，確認(rèn)了溫度-時間和裝量的獨立主效應(yīng)顯著，且二者之間的交互效應(yīng)不顯著。3批應(yīng)用結(jié)果表明，在最佳融解溫度-時間條件下，水痘疫苗原液的病毒滴度為（5.27±0.03） lgPFU/mL，符合水痘疫苗原液病毒滴度標(biāo)準(zhǔn)范圍，這一結(jié)果與文獻報道的觀點一致，即高溫短時間處理有利于病毒活性的保護。相對于2.5 L裝量，4.5 L裝量獲得的病毒滴度更低，這表明較小的裝量更有利于熱量的傳遞，受熱更為迅速和均勻，能夠有效減少病毒失活。

與傳統(tǒng)水浴融解對比，在各自最優(yōu)條件下，程序融解系統(tǒng)（60 ℃-60 min）和傳統(tǒng)水浴法（37 ℃- 20 min）融解水痘疫苗收獲液制備的原液病毒滴度均在5.1~5.3 lgPFU/mL，這一結(jié)果表明2種方法在維持病毒活性方面具有等效性。同時，程序融解系統(tǒng)在大規(guī)模生產(chǎn)中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢：該系統(tǒng)可處理裝量（2.5 L）是傳統(tǒng)方法裝量（0.25 L）的10倍，大幅度提升了水痘疫苗的生產(chǎn)效率；程序化控制的融解過程避免了人工操作帶來的批間差，符合GMP對產(chǎn)品質(zhì)量一致性的要求；程序融解系統(tǒng)配套使用的儲液袋取代傳統(tǒng)的玻璃瓶，避免了敞口操作，降低了污染及容器破損風(fēng)險。綜上，盡管病毒滴度均在5.1~5.3 lgPFU/mL，但程序融解系統(tǒng)在規(guī)?；灰呙缟a(chǎn)中發(fā)揮了不可替代的作用，今后在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用將越來越廣泛。

本研究確定了程序融解系統(tǒng)的最佳融解條件為60 ℃-60 min，裝量2.5 L，這時的水痘疫苗原液病毒滴度最高，有助于在大規(guī)模生產(chǎn)中確保疫苗質(zhì)量和提升生產(chǎn)效率，為資源高效利用和疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)化奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

作者

徐敏菁 程慶 王亮 謝蕾

上海生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗三室，上海 201403

通信作者：程慶，

Email：ursula100@msn.com

引用本文：徐敏菁, 程慶, 王亮, 等. 融解系統(tǒng)在水痘減毒活疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 國際生物制品學(xué)雜志, 2025, 48(6): 441-444.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240712-00049