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文章題目：Insights into the biogenic amine-generating microbes during two different types of soy sauce fermentation as revealed by metagenome-assembled genomes

文章鏈接：https://doi.org/10.26599/FSHW.2024.9250064

發(fā)表時(shí)間：2025-03-18

期刊：Food Science and Human Wellness

影響因子：7.46

研究背景與核心問題

生物胺（BAs）是發(fā)酵食品中由微生物通過氨基酸脫羧產(chǎn)生的有害化合物，過量攝入可能導(dǎo)致頭痛、高血壓等健康風(fēng)險(xiǎn)。醬油作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其JP（日式）和CP（廣式）工藝在原料配比、發(fā)酵條件（溫度、鹽度、接種酵母）上存在顯著差異，但兩者發(fā)酵過程中BAs生成微生物的多樣性及功能尚不明確。

這項(xiàng)研究基于宏基因組數(shù)據(jù)比較JP與CP工藝下BAs的分布差異及關(guān)鍵產(chǎn)胺微生物；解析微生物群落中BAs合成基因的豐度特征；通過宏基因組組裝基因組（MAGs）鑒定產(chǎn)胺微生物的物種和功能。

材料與方法

樣品采集：從工業(yè)醬油廠獲取JP和CP工藝發(fā)酵7、15、30、60、90、120天的醬醪樣品（各階段生物重復(fù)混合）。

理化分析：測定pH、鹽度（NaCl）、總酸度（TA）、氨基態(tài)氮（AAN）及8種BAs含量（腐胺、酪胺、組胺等）。

宏基因組測序：

• DNA提取、文庫構(gòu)建（Illumina NovaSeq 6000平臺，2×150 bp）；

• 序列組裝（IDBA-UD）、基因預(yù)測（MetaGeneMark）、去冗余（CD-HIT）；

• 物種注釋（DIAMOND比對NCBI-NR庫）；

• BAs合成基因注釋（KEGG數(shù)據(jù)庫，閾值：氨基酸相似性>30%，覆蓋度>95%）。

MAGs重建與分析：

• 基因組分箱（CONCOCT）、質(zhì)量評估（CheckM，完整性>80%，污染<10%）；

• 物種分類（GTDB-Tk）、功能注釋（Prodigal、KofamScan）；

• 毒力基因鑒定（VFDB數(shù)據(jù)庫，針對肺炎克雷伯菌）。

統(tǒng)計(jì)分析：

• 差異顯著性（ANOVA、t檢驗(yàn)）、相關(guān)性分析（Spearman）；

• 微生物-BAs基因共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)（Cytoscape，|ρ|≥0.6，P<0.05）。

研究結(jié)果

01 醪醋發(fā)酵過程中的理化特性和BA概況

BA分析表明，腐胺、組胺和酪胺是兩種發(fā)酵過程中的主要BAs，但不同BAs含量的變化趨勢不同（圖1）。在JP發(fā)酵過程中，腐胺在后期三個(gè)階段是最豐富的BA物種（717.22 mg/kg），其次是酪胺（239.46 mg/kg）和組胺（154.69 mg/kg）（圖1A）。然而，在初始階段（發(fā)酵7～15 d）含量急劇增加后，這三個(gè)BA的含量在后期三個(gè)階段保持穩(wěn)定。此外，還檢測到尸胺，發(fā)酵結(jié)束時(shí)含量為（34.54±1.83）mg/kg。但精氨酸含量從21.37 mg/kg下降到8.19 mg/kg（P＜0.05）。發(fā)酵過程中未檢測到色氨酸。CP發(fā)酵過程中，三種BAs（腐胺、酪胺和組胺）的濃度從發(fā)酵初期迅速增加（P＜0.05）（圖1B）。發(fā)酵結(jié)束時(shí)（120 d）腐胺、酪胺和組胺的含量分別為（2200.48±350.73）、（1432.07±151.20）和（327.51±40.11）mg/kg。與JP發(fā)酵相比，CP發(fā)酵過程中苯乙胺的含量較高。酪胺的含量與先前的研究相當(dāng)，在醪醋發(fā)酵的第三個(gè)月，酪胺濃度增加到2073.27 mg/kg。一些研究建議對食品中的BA含量進(jìn)行限制。建議食品中總鋇含量為1000 mg/kg，組胺含量為100 mg/kg，酪胺含量為100～800 mg/kg，β-苯乙胺含量為30 mg/kg。此外，本研究還比較了發(fā)酵結(jié)束時(shí)（120 d）8個(gè)BA之間的差異。在檢測到的8種BAs中，CP中的5種BAs（腐胺、酪胺、組胺、苯乙胺和色氨酸）的含量明顯高于JP中的含量（P＜0.05）（圖1C）。兩種不同發(fā)酵工藝中BA濃度的明顯差異可歸因于環(huán)境因素，特別是溫度、氧氣可用性、光周期和鹽度，以及起始物培養(yǎng)物（含或不含起始物魯氏接合酵母），這些因素在JP和CP制造工藝中有所不同。

圖1 在發(fā)酵過程中從（A）JP醬油和（B）CP醬油的醬油醪液樣本中鑒定的BA譜圖;（C）在兩種不同發(fā)酵過程中120 d發(fā)酵后醪液樣本中BA的比較

02 不同醬油發(fā)酵類型的微生物群落特征變化

從屬的角度來看，四聯(lián)球菌屬、葡萄球菌和魏斯氏菌與真菌曲霉一起主導(dǎo)了JP和CP群落（圖2），這與之前在醬油樣本中的一項(xiàng)研究結(jié)果相似。在這些屬中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，四聯(lián)球菌屬的豐度急劇增加（在JP的所有序列中從0.02%增加到59.2%，在CP中從0.01%增加到36.60%），但在JP樣本中，四聯(lián)球菌屬的相對豐度較高（發(fā)酵60～120 d）。作為嗜鹽性實(shí)驗(yàn)室，四聯(lián)球菌屬已被確定為醬油中的主要微生物。相比之下，在所有發(fā)酵階段，CP中葡萄球菌的豐度都高于JP中，平均豐度分別為32.6%和8.5%（圖2）。然而，JP和CP樣品中魏斯氏菌在發(fā)酵15 d后豐度均呈下降趨勢，表明魏斯氏菌不耐鹽。同樣，在整個(gè)發(fā)酵過程中，曲霉菌種群數(shù)量下降（在JP中從32.1%降至0.12%，在CP中從17.1%降至0.65%）（圖2）。發(fā)酵前階段較高的曲霉相對豐度來源于曲霉，其中曲霉菌種被用作起始培養(yǎng)物。此外，在CP群落中，芽孢桿菌的豐度（平均3.16%）高于JP群落（0.22%）。其他真菌的豐度相對較低，如酵母菌共聚糖酵母、畢赤酵母、念珠菌、克魯維酵母、擬威克酵母屬和釀酒酵母。

圖2 在兩個(gè)不同的發(fā)酵過程中，15個(gè)最豐富屬的微生物分類組成在屬一級的分布情況

03 BA基因的概況及其與醪液化學(xué)和生物體的關(guān)系

特定基因的豐度是根據(jù)相對豐度計(jì)算的。檢測到的參與腐胺合成的基因包括兩個(gè)脫羧酶基因（精氨酸脫羧酶，speA；和鳥氨酸脫羧酶，odc）和四個(gè)非脫羧酶基因（胍基丁胺酶，speB；精氨酸脫亞胺酶，aguA；精氨酸酶，arg；和腐胺氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶，ptcA）（圖3）。這些基因表現(xiàn)出不同的豐度特征?；騭peB、arg和odc是JP中含量最高的基因，而基因speB、arg和odc以及speA在CP中占主導(dǎo)地位。其中，JP中ODC基因的相對豐度在發(fā)酵15 d后從2.6×10-5增加到4.9×10-4，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)（120 d）豐度最高（4.9×10-4）。在JP和CP發(fā)酵過程中，ptcA基因的豐度增加，豐度分別從2.1×10-6增加到1.7×10-5，從5.9×10-6增加到了3.3×10-5。然而，在整個(gè)發(fā)酵過程中，speA基因的豐度急劇下降（在JP中從1.4×10-5降至2.2×10-6，在CP中從1.6×10-4降至1.8×10-5）。此外，參與酪胺生成的酪氨酸脫羧酶基因（tyrDC）豐度在每個(gè)發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)上都增加了（在JP中從1.8×10-6增加到1.4×10-5，在CP中從6.7×10-6增加到了2.8×10-5），并且在CP中比在JP中高（平均為3.3倍）。因此，推測CP混合物樣品中檢測到的較高濃度的酪胺（圖1）與酪胺生成物中酪胺酮C的高表達(dá)水平有關(guān)。最后，還鑒定了編碼產(chǎn)生組胺（hdc）和色氨酸（tdc）的雜環(huán)胺脫羧酶的基因（圖3）。其中，hdc基因在JP中的豐度相對較低，平均為1.3×10-6，在CP中為3.3×10-6。此外，還檢測到一個(gè)參與尸胺生成的賴氨酸脫羧酶基因（ldc），其在JP中的平均豐度為3.5×10-6，在CP中的平均豐度的1.7×10-5。CP的speE（編碼精胺合酶）基因豐度高于JP。然而，未檢測到編碼精氨酸合酶和編碼苯丙氨酸脫羧酶用于苯乙胺合成的基因。雖然在本研究中未發(fā)現(xiàn)pdcA基因，但在60～120 d的發(fā)酵周期中，JP中的苯乙胺平均為6.68 mg/kg，CP中的苯乙酰胺平均為78.38 mg/kg。

圖3 在兩種不同的醬油發(fā)酵過程中參與生物胺生成的基因的相對豐度

04 基因組重建和MAG豐度

在連續(xù)篩選和基因組質(zhì)量控制后，共重建了JP和CP樣品中混合質(zhì)粒組中的44個(gè)MAG，其中15個(gè)基因組的完整性在80%以上，污染少于10%（圖4）。這15個(gè)基因組的基因組大小在1487942～4833112 bp之間，平均為2427150 bp；每個(gè)基因組的連續(xù)序列數(shù)在60到548之間；每個(gè)基因的ORF數(shù)在1502到4829之間。

FastANI被用于進(jìn)行分類學(xué)歸屬并評估MAG的新穎性，結(jié)果顯示一個(gè)MAG與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的原核生物基因組之間的相似度較低（＜95%）。新發(fā)現(xiàn)的物種（MAG12）被鑒定為棒狀桿菌屬，屬于棒狀桿菌科家族，與棒狀桿菌科變種聚類，相似度達(dá)到85.9%（圖4）。需要指出的是，雖然發(fā)酵過程中存在較高豐度的某些曲霉屬物種，但本研究并未完整檢索到真核生物基因組，因?yàn)檫@些物種的基因組通常較大，從宏基因組數(shù)據(jù)集中重構(gòu)較為困難。在JP樣品的發(fā)酵初期階段（7～30 d），W. cibaria的豐度顯著較高，但在中期至后期階段（60～120 d）其豐度略有下降。

圖4 從醬油泥狀代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中重構(gòu)的精選MAGs的屬分類歸屬

05 BA基因在MAG中的分布模式

本研究的元基因組組裝、基因組篩選和注釋使我們能夠區(qū)分醬油發(fā)酵微生物組中攜帶各種BA基因的宿主。研究發(fā)現(xiàn)，在15個(gè)觀察到的MAG中，有10個(gè)至少包含一個(gè)與BA生成有關(guān)的基因（每個(gè)MAG中包含一個(gè)到五個(gè)基因）。MAG中的這些基因參與了四種類型的BA合成，包括腐胺（speA、speB、aguA、arg、odc和ptcA）、尸胺（ldc）、精胺（speE）和酪胺（tyrDC）（圖5B），反映了醬油發(fā)酵過程中不同物種或菌株的BA生產(chǎn)能力。在檢測到的四個(gè)脫羧酶基因（speA、odc、ldc和tyrDC）中，沒有發(fā)現(xiàn)所有MAG中都有一個(gè)單一的基因。在腐胺的產(chǎn)生方面，7個(gè)屬于芽孢桿菌屬（MAG14）、棒狀桿菌屬（MAG12）、克雷伯氏菌屬（MAG13）、片球菌（MAG15）、羅斯氏菌屬（MAG1）、葡萄球菌屬（MAG8）和動物球菌屬（MAG9）的MAG攜帶了speB基因（圖5B）。除了兩個(gè)MAGs（MAG13和MAG15）外，上述所有MAG都攜帶arg基因。K. pneumoniae（MAG13）和P. pentosaceus（MAG15）被發(fā)現(xiàn)擁有odc基因。在歸類為K. pneumoniae（MAG13）和P. acidilactici（MAG4）的MAG中鑒定出了speA、aguA和ptcA基因。這些結(jié)果表明，在醬油發(fā)酵過程中，有可能通過兩種不同的途徑從精氨酸合成腐胺：鳥氨酸脫羧途徑（ODC）和肌氨酸脫氨基途徑（AGDI）。ODC途徑涉及將精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸（arg），然后使鳥氨酸脫羧形成腐胺（odc），而AGDI途徑涉及將精氨酸脫羧形成肌氨酸（精氨酸脫羧酶，speA），使肌氨酸脫氨基形成N-氨甲酰腐胺（肌氨酸脫氨基酶，aguA），最后使N-氨甲酰腐胺水解形成腐胺（腐胺氨甲酰轉(zhuǎn)移酶，ptcA）。令人意外的是，這些MAG中沒有一個(gè)包含了上文提到的腐胺完整生產(chǎn)途徑，因?yàn)樗鼈儾⒉话c這一特定途徑相關(guān)的所有基因，這表明在腐胺的生產(chǎn)過程中，不同的MAG之間存在協(xié)同作用。這在一定程度上與之前的報(bào)告相符，那些擁有ODC途徑以生產(chǎn)腐胺的物種被檢測到，而擁有完整的AGDI途徑的物種則未被發(fā)現(xiàn)?？紤]到K. pneumoniae（MAG13）擁有兩個(gè)基因（speA和speB），推測這些物種可能通過精氨酸的脫羧反應(yīng)（speA）和肌氨酸的酶解作用（speB）來產(chǎn)生腐胺。已有報(bào)告表明，K. pneumoniae能夠產(chǎn)生腐胺、組胺和尸胺。此外，ldc基因僅在隸屬于K. pneumoniae的MAG13中被發(fā)現(xiàn)。有趣的是，在所檢測的所有菌種中，只有K. pneumoniae攜帶了超過兩個(gè)的脫羧酶基因（speA、odc和ldc）（圖5B），這表明該菌可能有能力脫羧多種氨基酸（精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸）。此外，兩個(gè)MAG菌株攜帶了編碼脫羧酶的tyrDC基因，包括屎腸球菌（MAG10）和類腸膜魏斯氏菌（MAG5），這表明它們可能通過從各自的預(yù)氨基酸酪氨酸進(jìn)行一步脫羧反應(yīng)來產(chǎn)生酪胺。屎腸球菌經(jīng)常在各類發(fā)酵食品中被分離或檢測到。本研究中關(guān)于屎腸球菌菌種酪胺產(chǎn)生的研究結(jié)果并不出人意料，因?yàn)閺母鞣N發(fā)酵食品中分離出的屎腸球菌菌株大多已被鑒定為酪胺和苯乙胺產(chǎn)生菌，且已被發(fā)現(xiàn)攜帶tyrDC基因。據(jù)報(bào)道，從韓國泡菜中分離出的類腸膜魏斯氏菌菌株能夠產(chǎn)生多種胺類物質(zhì)，包括酪胺。尤其值得注意的是，在T. halophilus（MAG2）中并未發(fā)現(xiàn)BA基因，而在JP和CP發(fā)酵的中后期階段，T. halophilus是最占優(yōu)勢的菌種（圖5A）。這一發(fā)現(xiàn)與之前的報(bào)告相似，即在14個(gè)T. halophilus菌株中，只有一個(gè)菌株的基因組中鑒定出了單一的組氨酸脫羧酶基因。但與多項(xiàng)研究結(jié)果并不一致，這些研究顯示某些T. halophilus菌株攜帶了多種BA基因，如酪氨酸和組氨酸脫羧酶基因，在發(fā)酵食品中發(fā)揮著積累酪胺和組胺的關(guān)鍵作用。此外，在微生物群落水平上檢測到的參與組胺（hdc）和色胺（tdc）合成的基因（圖3）并未在任何一個(gè)MAG中被識別，這表明這些基因可能存在于本研究中的其他未組裝微生物中，因此需要更深入的宏基因組測序。最后，關(guān)于這些關(guān)鍵物種（MAGs）在醬油發(fā)酵過程中產(chǎn)生BA的預(yù)測代謝途徑概覽展示在圖5C中。鑒于雞葡萄球菌（MAG8）在CP發(fā)酵的中后期階段具有較高的豐度（圖5A），且其攜帶有產(chǎn)生腐胺的基因（arg和speB）（圖5C），推斷腐胺的高含量與這一物種在CP樣本中的高豐度有關(guān)。

圖5 （A）各混樣MAG的豐度分布，（B）MAG中的BA基因，（C）預(yù)測的大醬發(fā)酵過程中參與BA形成的MAG

研究結(jié)論

這項(xiàng)研究確定了BA譜型和微生物群落組成上的差異，并觀察了兩種不同類型的醬油發(fā)酵過程（JP和CP）中負(fù)責(zé)BA生成的微生物以及相關(guān)代謝途徑。CP樣品中三種BA（腐胺、酪胺和組胺）的含量顯著高于JP樣品。最豐富的細(xì)菌屬包括四聯(lián)球菌屬、葡萄球菌屬和芽孢桿菌，但其相對豐度在不同發(fā)酵類型間存在差異。對微生物群落和功能基因組進(jìn)行注釋，揭示了與BA合成相關(guān)的微生物功能潛力。特別是，從宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)中恢復(fù)的微生物基因組進(jìn)一步細(xì)化了關(guān)鍵成員的了解，并揭示了與醬油發(fā)酵過程中涉及的各種BA生成基因相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。未來需要進(jìn)一步努力，通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)評估基因表達(dá)，并研究不同物種在醬油發(fā)酵過程中的代謝相互作用。

參考文獻(xiàn)

Tan G, Wang Y, Hu M, et al. Insights into the biogenic amine-generating microbes during two different types of soy sauce fermentation as revealed by metagenome-assembled genomes. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250064. https://doi.org/10.26599/FSHW.2024.9250064

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