傳統(tǒng)ADC已證明其價值，但也暴露了局限性：治療窗口窄、靶向毒性、耐藥性、異質(zhì)性高等。新一代技術(shù)旨在通過以下核心特征解決這些問題：

1.高度均一性：從DAR隨機分布的“混合物”變?yōu)镈AR精確、位點特異的“單一產(chǎn)品”。

2.精準(zhǔn)遞送：利用更穩(wěn)定的連接子和新型載荷，確保藥物在正確時間、正確地點釋放。

3.更強效力與新型作用機制：使用更強效的載荷或非細胞毒性藥物，以克服耐藥并擴大治療領(lǐng)域。

4.增強腫瘤穿透與選擇性：通過新型抗體格式或前藥策略，提高對實體瘤的療效并減少對正常組織的毒性。

新一代ADC技術(shù)正在從一門“藝術(shù)”轉(zhuǎn)變?yōu)橐婚T高度可控的“科學(xué)”。其發(fā)展趨勢是：

• 設(shè)計理性化：基于對靶點生物學(xué)、載荷藥理和連接子化學(xué)的深刻理解進行理性設(shè)計。

• 技術(shù)平臺化：形成模塊化的抗體、連接子、載荷平臺，可快速組合成候選藥物。

• 應(yīng)用多元化：從晚期腫瘤治療向更前線治療、輔助治療乃至非腫瘤領(lǐng)域拓展。

• 聯(lián)合治療常規(guī)化：與免疫檢查點抑制劑、靶向藥等聯(lián)合使用，成為腫瘤綜合治療的基石方案。

最終目標(biāo)是通過持續(xù)的技術(shù)迭代，開發(fā)出療效更高、毒性更低、應(yīng)用更廣的“智能”靶向藥物，為更多患者帶來希望。

今天為大家解讀一篇關(guān)于新一代ADC藥物技術(shù)的文章。以期為大家在ADC藥物研發(fā)設(shè)計方面提供參考。

1 引言

抗體偶聯(lián)藥物通過抗體的靶向特異性，選擇性地將具有藥理活性的小分子遞送至病變細胞或組織，從而最大限度地減少對健康組織的不良影響。這種生物制品與小分子化合物的結(jié)合為疾病治療提供了新的機遇，同時也給藥物研發(fā)帶來了獨特的挑戰(zhàn)。第一代ADC在臨床上驗證了有效性，同時也揭示了一些局限性，并推動了該技術(shù)的進一步改進。傳統(tǒng)ADC主要使用auristatin或maytansinoid類微管蛋白抑制劑，通過表面賴氨酸或鏈間半胱氨酸隨機連接至抗體。較新進入臨床的ADC則包含了用于定點偶聯(lián)的工程化半胱氨酸和新型DNA損傷劑。本文概述了已在臨床前研究中展現(xiàn)出前景并有望轉(zhuǎn)化進入臨床的關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新。這些創(chuàng)新包括更多的細胞毒性藥物種類，如Tubulysins、對稱和不對稱苯并二氮雜?二聚體、蒽環(huán)類藥物以及鵝膏毒肽。日益豐富的連接子可實現(xiàn)二硫鍵重橋連，以及高疏水性藥物或高DAR值下的藥物偶聯(lián)。通過引入半胱氨酸、擴展遺傳密碼、聚糖工程和化學(xué)酶法，已開發(fā)出多種穩(wěn)健的定點偶聯(lián)方案。最后，探索遞送調(diào)節(jié)免疫激活和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的藥物，用于癌癥以外的適應(yīng)癥?？傊?，這些進展為增強和擴大ADC作為新型靶向療法，治療癌癥及其他未滿足醫(yī)療需求高的疾病的治療帶來了巨大希望。

下文將總結(jié)藥物-連接子設(shè)計、抗體工程以及ADC在癌癥領(lǐng)域外的潛在應(yīng)用方面的最新進展。表1提供了ADC代表性技術(shù)和構(gòu)建的概要。

表1 ADC技術(shù)與示例

2 新型細胞毒素有效載荷和連接子

2.1 微管蛋白抑制劑

基于auristatin和maytansinoid的ADC藥物的臨床成功，促進了對其他靶向微管蛋白有效載荷的評估。每種新有效載荷都有望在效力、旁觀者效應(yīng)、耐藥譜、副作用譜、偶聯(lián)難易度等方面提供一套互補的特性。其他有效載荷包括新型auristatins、dolastatins和maytansines，以及新型化學(xué)結(jié)構(gòu)類型，如隱藻素和Tubulysins。下文將以Tubulysins為例進行說明。

Tubulysins最初從粘細菌中分離，是一類獨特的肽類化合物，能強效抑制微管蛋白聚合。許多不同的Tubulysins已從天然來源分離或通過合成獲得。Tubulysin D（圖1）是該類化合物中已知效力最強的成員之一，在多種癌細胞系中表現(xiàn)出皮摩爾級的細胞毒性活性。作為ADC有效載荷，一些Tubulysins既能對多藥耐藥腫瘤發(fā)揮強效活性，又能殺死旁觀者細胞。天然Tubulysins的N,O-縮醛部分化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，促使人們尋找能保留高細胞毒性活性的更穩(wěn)定的衍生物。Cohen等人成功制備了曲妥珠單抗與穩(wěn)定的Tubulysin類似物Tub-OH和Tub-OMOM的偶聯(lián)物。通過不可裂解的N-羥基琥珀酰亞胺連接子，將131I標(biāo)記和未標(biāo)記的Tubulysins與表面賴氨酸偶聯(lián)。

圖1 tubulysin D的結(jié)構(gòu)

2.2 苯并二氮雜?二聚體

吡咯并苯并二氮雜?二聚體是一類強效、序列選擇性的DNA小溝結(jié)合劑，以SJG-136為例，圖2所示。SJG-136也稱為SG2000，在支持性護理下，以最大耐受劑量30μg/m2/天，連續(xù)給藥3天（21天為一個周期），在晚期惡性腫瘤中顯示出初步的抗腫瘤活性跡象。通常，每個PBD單體在N10-C11位置含有一個親電亞胺基團，可與鳥嘌呤堿基的C2-NH?基團共價連接。PBD能在低皮摩爾濃度下誘導(dǎo)DNA鏈間交聯(lián)和細胞毒性。

圖2 SJG-136/SG2000結(jié)構(gòu)示意圖（一種吡咯并苯二氮?二聚體）

吲哚啉并苯并二氮雜?二聚體是一個小溝結(jié)合劑家族，具有親電亞胺基團。與PBD類似，游離的IGN在體外和體內(nèi)均具有強效細胞毒性。含有對稱雙亞胺IGN的ADC如預(yù)期般誘導(dǎo)了共價DNA加合物和交聯(lián)；然而，小鼠治療導(dǎo)致了延遲的毒性和死亡。相比之下，含有單亞胺的IGN僅誘導(dǎo)DNA烷基化。與基于IGN二聚體的ADC相比，含有可裂解二硫鍵連接子的單亞胺IGN抗CD33 ADC在體內(nèi)表現(xiàn)出高效力，且早期和晚期毒性降低，圖3所示。在DAR約為3時，該ADC顯示出對急性髓系白血病異種移植瘤的最小有效劑量為0.6 mg/kg，在小鼠中的最大耐受劑量為40 mg/kg。

圖3 IMGN-779結(jié)構(gòu)示意圖，一種含有吲哚并苯二氮?二聚體DGN462的抗CD33 ADC

2.3 蒽環(huán)類藥物

這些DNA嵌入劑是應(yīng)用最廣泛的抗癌藥物類別之一。蒽環(huán)類藥物被認為通過阻斷拓撲異構(gòu)酶II的活性并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的形成來阻止DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄?；诎⒚顾氐腁DC是最早進行臨床評估的ADC之一。然而，該化合物中等程度的效力、潛在的不可逆心臟毒性以及相關(guān)的耐藥機制阻礙了其更廣泛的開發(fā)。新型蒽環(huán)類藥物如奈莫柔比星及其主要代謝物PNU-159682（圖4）有潛力克服這些限制。與阿霉素相比，PNU-159682對一組癌細胞系的效力提高了1000倍，并且對具有多藥耐藥表型的細胞保留了活性。這些特性與PNU-159682對DNA異常緊密和穩(wěn)定的結(jié)合有關(guān)。

圖4 強效蒽環(huán)類化合物與抗CD22-NMS249的結(jié)構(gòu)

Genentech團隊通過mc-vc-PAB和二乙胺連接子將PNU-159682與抗CD22單抗偶聯(lián)得到CD22-NMS249（圖4）?？笴D22抗體是pinatuzumab的THIOMAB版本?？笴D22-NMS249在體外對親本非霍奇金淋巴瘤細胞系的效力比pinatuzumab vedotin強2至20倍。此外，單次1或2 mg/kg劑量的抗CD22-NMS249對四種NHL異種移植瘤均顯示出體內(nèi)療效。與pinatuzumab vedotin不同，抗CD22-NMS249克服了由p-糖蛋白過表達或在pinatuzumab vedotin存在下連續(xù)傳代誘導(dǎo)的耐藥性，這與游離奈莫柔比星及其主要代謝物不是p-糖蛋白底物的發(fā)現(xiàn)一致。

2.4 鵝膏毒肽

這些化合物構(gòu)成了一個雙環(huán)八肽毒素家族。研究最深入的成員是α-鵝膏蕈堿（圖5），由毒鵝膏菌產(chǎn)生。α-鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶II的強效特異性抑制劑。轉(zhuǎn)錄停滯會關(guān)閉翻譯和正常代謝過程，引發(fā)增殖和靜止腫瘤細胞的死亡。這種細胞毒性機制與當(dāng)前臨床階段ADC的機制互補。

圖5 α -鵝膏蕈肽與chiHEA125-ama ADC的結(jié)構(gòu)

在一項研究中，α-鵝膏蕈堿通過戊二酸連接子與抗EpCAM單抗chiHEA125的表面賴氨酸偶聯(lián)。在DAR為4-8時，該ADC對Colo205和MCF-7腫瘤細胞表現(xiàn)出個位數(shù)皮摩爾的效力，相對于非結(jié)合ADC具有驚人的100,000倍選擇性。在BxPc-3胰腺癌異種移植模型中測試時，單次2 mg/kg劑量后觀察到部分腫瘤消退，間隔一周給予兩次4 mg/kg劑量后觀察到完全消退。治療通常耐受性良好，然而，單次6和12 mg/kg劑量與明顯的肝毒性相關(guān)。這種副作用與意外鵝膏毒肽中毒后觀察到的肝毒性一致。盡管α-鵝膏蕈堿的膜滲透性差，但它可通過肝臟特異性轉(zhuǎn)運蛋白主動攝取。這個問題是鵝膏毒肽ADC項目的重要考量。

2.5 二硫鍵重橋連

目前處于臨床測試的ADC中，大多數(shù)涉及通過抗體的鏈間半胱氨酸殘基進行偶聯(lián)。這種方法的局限性包括：對于DAR約4時形成異質(zhì)混合物，對于DAR約2時存在大量未偶聯(lián)的單抗，對于DAR約8時（使用傳統(tǒng)藥物-連接子）藥代動力學(xué)和療效欠佳，丟失了通常穩(wěn)定重-輕和重-重鏈相互作用的共價鍵，以及傳統(tǒng)馬來酰亞胺連接子的血漿不穩(wěn)定性。原則上，這些限制可以通過"重橋連"連接子克服，該連接子與原始二硫鍵的配對半胱氨酸形成共價鍵，這一策略最初是為蛋白質(zhì)定點聚乙二醇化開發(fā)的。該方法涉及部分或完全還原鏈間二硫鍵，然后與藥物-連接子反應(yīng)，后者共價"橋接"來自原始二硫鍵的半胱氨酸硫原子（圖6）。在大多數(shù)情況下，一個2或3碳的間隔基連接硫原子。這種方法的特點是，提供了定點特異性，而無需對抗體進行任何工程改造。

圖6 二硫鍵重橋接策略示意圖。星號表示通過連接子偶聯(lián)的化學(xué)載荷，該連接子通過短（2或3碳）化學(xué)間隔基重新連接先前配對的半胱氨酸

關(guān)于這種策略的例子還有很多，例如圖7所示。據(jù)報道，所得硫醚鍵在血漿中比使用馬來酰亞胺化學(xué)形成的鍵更穩(wěn)定，后者容易發(fā)生逆邁克爾反應(yīng)。原則上，通過對完全還原的抗體進行重橋連，可以獲得均質(zhì)DAR=4的ADC，或使用Fabs或其他抗體支架獲得均質(zhì)DAR=1的偶聯(lián)物。實際上，在某些情況下，鏈的完全重橋連仍然是一個挑戰(zhàn)，部分原因是鉸鏈區(qū)半胱氨酸之間形成鏈內(nèi)橋，這些半胱氨酸僅由兩個氨基酸隔開。使用更長的碳間隔基可能會加劇這個問題。

圖7 基于單砜(a)或3,4-二溴馬來酰亞胺(b)雙烷基化反應(yīng)的二硫鍵重橋接方法

2.6 Fleximer?聚合物連接子

多項研究已證明在使用傳統(tǒng)藥物-連接子時，具有確定且低DAR值（通常為2）的均質(zhì)ADC的優(yōu)勢。然而，Mersana采取了不同的策略，使用親水性聚合物連接子生成具有高且異質(zhì)DAR值的ADC。這種可生物降解的聚合物連接子最初是為了提供一種喜樹堿前藥衍生物，以克服該分子的藥代動力學(xué)限制。Mersana后來將這項技術(shù)用作克服某些ADC有效載荷疏水性限制的手段，并生成了DAR值在15至20范圍內(nèi)的ADC（圖8）。這些ADC在生理pH下相對穩(wěn)定，并在內(nèi)化進入酸性內(nèi)體后釋放有效載荷。使用Fleximer?在DAR約20時將長春花堿類似物連接到曲妥珠單抗，未觀察到Her2結(jié)合親和力有明顯損失?；谇字閱慰沟腁DC單次20 mg/kg劑量導(dǎo)致BT-474人乳腺癌異種移植瘤完全消退，治療后60天，100%的動物檢測不到腫瘤。相比之下，使用非結(jié)合ADC或未偶聯(lián)曲妥珠單抗與藥物-連接子的混合物治療后，僅觀察到輕微的腫瘤生長延遲，沒有腫瘤消退。

圖8 基于Fleximer聚合物技術(shù)的ADC基本結(jié)構(gòu)

3 抗體改造

藥物-連接子化學(xué)的創(chuàng)新與改造抗體的新方法相輔相成，以促進藥物偶聯(lián)。其中一個主要目的是生成具有確定DAR值的均質(zhì)ADC。如圖9所示，已經(jīng)開發(fā)了幾種策略來使用工程化抗體或酶介導(dǎo)的偶聯(lián)制備定點特異性ADC。定點特異性ADC表現(xiàn)出改善的性能，主要是因為沒有快速清除的高DAR物種，并且與通過半胱氨酸硫醇進行馬來酰亞胺偶聯(lián)相比，消除了逆邁克爾反應(yīng)。

圖9 位點特異性ADC的制備方法示意圖（ SECIS =硒代半胱氨酸插入序列）

3.1 工程化半胱氨酸

人IgG的恒定區(qū)不存在不成對半胱氨酸，可變區(qū)也很少出現(xiàn)。因此，引入的半胱氨酸可以提供可利用的化學(xué)手柄。然而，不成對半胱氨酸可能導(dǎo)致表達/分泌減少、蛋白質(zhì)聚集、二硫鍵混亂以及其他生產(chǎn)挑戰(zhàn)。這些因素限制了引入半胱氨酸的優(yōu)選位點數(shù)量，并促使人們經(jīng)驗性地尋找對特定應(yīng)用最優(yōu)的位點。

Junutula等人率先利用工程化半胱氨酸制備定點特異性ADC，即THIOMABs。這項工作利用了之前開發(fā)的噬菌體展示方法，來識別將活性半胱氨酸插入抗體Fab片段的位點。在全長人IgG1背景下評估了輕鏈上的8個位點和重鏈上的4個位點，發(fā)現(xiàn)重鏈CH1結(jié)構(gòu)域中的A114C位點表現(xiàn)出良好的表達和偶聯(lián)效率。即使在這個優(yōu)選位點，發(fā)現(xiàn)引入的半胱氨酸在表達和純化后與谷胱甘肽、游離半胱氨酸等其他含硫醇化合物甚至抗體輕鏈形成二硫鍵連接。對于偶聯(lián)，將所有溶劑可及的（即引入的和鏈間的）二硫鍵還原，然后使用硫酸銅或脫氫抗壞血酸重新氧化鏈間二硫鍵。

與傳統(tǒng)ADC相比，TDC在體外表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力，并且在OVCAR-3等卵巢癌模型中表現(xiàn)出相似或更好的臨床前療效。單次6 mg/kg劑量的TDC在每個模型中都能導(dǎo)致已建立腫瘤的消退或長期控制。重要的是，TDC在大鼠中表現(xiàn)出更優(yōu)的藥代動力學(xué)，在大鼠和食蟹猴中的耐受性提高了三到四倍。

工程化半胱氨酸顯著提高了與馬來酰亞胺形成的硫醚鍵的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，帶正電荷的環(huán)境促進了琥珀酰亞胺環(huán)的水解，開環(huán)最大限度地減少了因逆邁克爾反應(yīng)導(dǎo)致的藥物損失可能性。這項研究還檢驗了將半胱氨酸引入抗體Fc區(qū)的影響。除了MUC16，針對Her2、STEAP1和CD22的抗體，在使用MMAE、DM1和蒽環(huán)類有效載荷時，TDC也顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)ADC的優(yōu)勢。

3.2 酶輔助偶聯(lián)

定點偶聯(lián)的另一種策略是利用酶對其底物的特異性。該方法利用了甲酰甘氨酸生成酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、分選酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來修飾抗體的多肽或聚糖結(jié)構(gòu)。在某些情況下，首先通過引入內(nèi)部或末端寡肽標(biāo)簽來修飾抗體序列以促進催化。引入標(biāo)簽的潛在免疫原性是一個理論上的關(guān)注點。

3.2.1 微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG）催化伯胺與谷氨酰胺的γ-羧酰胺之間形成異肽鍵。TG幾乎存在于所有生物體中。來自放線菌的微生物TG廣泛用于食品工業(yè)，并曾用于生物素、聚乙二醇和放射性金屬螯合劑修飾蛋白質(zhì)。在這些早期研究中，對全長鼠源單抗和肽標(biāo)簽化的單鏈Fv抗體進行了TG標(biāo)記。研究證實，這種微生物TG對基于胺的底物具有混雜性，但對蛋白質(zhì)谷氨酰胺的識別更具限制性。

Schibli及其同事研究了將熒光團與天然和去糖基化形式的嵌合IgG1抗L1-CAM抗體chCE7的偶聯(lián)。盡管最大取代率為每個mAb一個熒光團，但與去糖基化mAb的偶聯(lián)效率明顯更高。該小組的后續(xù)研究表明，酶法去糖基化的chCE7優(yōu)先在Q295位點被修飾，而N297Q去糖基化突變體優(yōu)先在Q295和Q297位點被修飾。推測對這些谷氨酰胺的特異性源于它們位于人IgG1的柔性區(qū)域。

Rinat在人IgG1的90個表面可及位點插入了谷氨酰胺標(biāo)簽。12個位點適合偶聯(lián)，研究重點分別是在重鏈或輕鏈C末端添加LLQGA或GGLLQGA。使用抗M1S1抗體和通過可裂解AcLys-vc-PAB連接子連接的MMAD，制備了定點特異性和傳統(tǒng)ADC。通過TG介導(dǎo)的重鏈或輕鏈標(biāo)簽偶聯(lián)，在體外觀察到等效的效力，以及對小鼠BxPC3胰腺癌異種移植瘤的等效療效；然而，輕鏈偶聯(lián)在大鼠血漿中表現(xiàn)出更優(yōu)的藥代動力學(xué)和穩(wěn)定性。大鼠血漿中的不穩(wěn)定性歸因于纈氨酸-瓜氨酸二肽的裂解，而不是TG異肽鍵的降解。相反，對于使用C6-vc-PAB連接子和新型auristatin抑制劑Aur-0101制備的ADC，在小鼠血漿中觀察到比大鼠血漿中更大的不穩(wěn)定性；然而，在猴和人血漿中觀察到了良好的穩(wěn)定性。使用TG制備了高度均質(zhì)的ADC；然而，為了消除對天然谷氨酰胺的非靶向偶聯(lián)，通過將Q295突變?yōu)樘於０帆@得了最佳結(jié)果。

3.2.2 甲酰甘氨酸生成酶

FGE是一個廣泛分布的酶家族，催化I型硫酸酯酶活性位點內(nèi)半胱氨酸在翻譯過程中氧化為甲酰甘氨酸。半胱氨酸側(cè)鏈從─CH2SH轉(zhuǎn)化為─CH2CH═O對于細胞硫酸酯酶的活性至關(guān)重要。醛基提供了相對于20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的正交官能團。哺乳動物和細菌的FGE都識別一個五聚體CxPxR共有序列，該序列可以插入異源蛋白質(zhì)中。

FGE標(biāo)簽在插入抗體重鏈和輕鏈的內(nèi)部和羧基末端時都表現(xiàn)出耐受性。一種優(yōu)選方法是在重鏈羧基末端用SLCTPSRGS（FGE共有序列加粗）替換賴氨酸。為了補充內(nèi)源倉鼠FGE，抗體重鏈和輕鏈在同時過表達人FGE的中國倉鼠卵巢細胞中表達。含甲酰甘氨酸的抗體適合進行經(jīng)典醛基反應(yīng)以形成肟和腙偶聯(lián)物。為了提高血漿穩(wěn)定性，已使用Pictet-Spengler、HIPS和trapped-Knoevenagel連接來生成抗體和藥物-連接子之間高度穩(wěn)定的C─C鍵。

曲妥珠單抗在重鏈羧基末端進行了醛標(biāo)記，并與HIPS-谷氨酸-PEG2美登素藥物-連接子偶聯(lián)。通過疏水相互作用色譜去除未偶聯(lián)的單抗后，獲得了DAR為2的均質(zhì)ADC。與使用傳統(tǒng)賴氨酸化學(xué)制備的曲妥珠單抗-DM1（DAR=3.4）相比，該定點特異性ADC在體外細胞殺傷活性和對NCI-N87異種移植瘤的單次劑量體內(nèi)療效方面表現(xiàn)出相似或更好的效果。在小鼠中，定點特異性ADC的血清半衰期和暴露量比傳統(tǒng)ADC高30-40%，但低于未修飾的曲妥珠單抗。此外，在大鼠中以等效單次劑量給藥時，定點特異性ADC表現(xiàn)出比傳統(tǒng)ADC更低的毒性。正如預(yù)期，兩種ADC的毒性性質(zhì)相似。

3.2.3 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和其他聚糖工程

Asn-297是人IgG恒定區(qū)內(nèi)N-連接糖基化的唯一規(guī)范位點。由于其遠離抗原結(jié)合位點且對抗體藥代動力學(xué)影響最小，聚糖是具有吸引力的偶聯(lián)位點。用高碘酸鹽氧化天然聚糖產(chǎn)生活性醛基是常見的方法；然而，反應(yīng)條件可能導(dǎo)致異質(zhì)混合物、蛋氨酸殘基氧化以及結(jié)合活性喪失。

SynAffix描述了一種三步程序，用于制備具有精確定義DAR值的聚糖偶聯(lián)ADC。在一個例子中，首先用內(nèi)切糖苷酶Endo S處理天然抗體，該酶切割N-連接聚糖，留下單個GlcNAc，如果存在則保留巖藻糖殘基。接下來，使用牛β(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的Y289L突變體將含疊氮的糖轉(zhuǎn)移到抗體上。然后通過點擊化學(xué)連接藥物-連接子，得到DAR=2的ADC。

Zhou等人描述了一種替代程序，即首先在UDP-半乳糖和CMP-唾液酸存在下，使用β(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和α(2-6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶對抗體進行唾液酸化。溫和的高碘酸鹽氧化后，含醛基的抗體通過肟化學(xué)進行偶聯(lián)。使用這種方法，曲妥珠單抗與氨基氧基-Cys-mc-vc-PAB-MMAE藥物-連接子偶聯(lián)，生成DAR約2的ADC，該ADC包含具有0、1、2及更高DAR值的混合物。

Okeley等人描述了一種非酶促的代謝方法來改造抗體。將目標(biāo)抗體在有含硫醇巖藻糖類似物的培養(yǎng)基中表達，該類似物被整合到Asn-297聚糖中。游離硫醇使得能夠使用標(biāo)準(zhǔn)馬來酰亞胺化學(xué)與mc-vc-PAB-MMAE偶聯(lián)證實偶聯(lián)僅通過重鏈發(fā)生，得到的DAR約1.3。

3.3 非天然氨基酸和硒代半胱氨酸

另一種方法利用擴展的遺傳密碼，該密碼包含相對于20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸具有正交反應(yīng)性的非天然氨基酸。在這種方法中，通過工程化的tRNA和氨酰-tRNA合成酶對，將琥珀終止密碼子重新定向以摻入非天然氨基酸。迄今為止，已有超過100種不同的非天然氨基酸被摻入蛋白質(zhì)中。這種方法已被用于在大腸桿菌和哺乳動物細胞中體外表達的抗體。盡管琥珀終止密碼子在哺乳動物細胞中廣泛使用，但從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細胞中已能生產(chǎn)克/升級別的含非天然氨基酸的抗體。

曲妥珠單抗在重鏈A114位點用pAcF修飾，并通過含有三個乙二醇單元和非裂解連接子與MMAF偶聯(lián)。使用傳統(tǒng)馬來酰亞胺化學(xué)通過鏈間半胱氨酸將野生型曲妥珠單抗與MMAF偶聯(lián)作為對照。非天然氨基酸ADC和傳統(tǒng)ADC的DAR分別為2.0和3.8。盡管DAR較低，非天然氨基酸ADC在體外表現(xiàn)出與傳統(tǒng)ADC相當(dāng)?shù)募毎拘?，并且在NCI-N87和HCC-1954 Her2+異種移植模型中表現(xiàn)出相似或更好的療效。此外，在死亡率、體重、血液學(xué)和血清化學(xué)方面，非天然氨基酸ADC顯示出更好的耐受性?？傮w而言，與傳統(tǒng)ADC相比，非天然氨基酸ADC的治療窗口至少擴大了兩倍，部分原因是其更優(yōu)的血漿穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)。

Sec通常被稱為遺傳密碼中的"第21種氨基酸"，自然存在于約25種人類蛋白質(zhì)中，其中許多充當(dāng)氧化還原酶。Sec在UGA終止密碼子處的摻入是通過專用的tRNA、3' sec插入序列和SECIS結(jié)合蛋白的協(xié)調(diào)作用實現(xiàn)的。與半胱氨酸相比，Sec在弱酸性pH值下比硫醇鹽對應(yīng)物更具反應(yīng)性的親核試劑，從而能夠選擇性標(biāo)記Sec。此外，與馬來酰亞胺硫醚鍵相比，與Sec的砜偶聯(lián)可以提供更好的血漿穩(wěn)定性。

3.4 替代形式和掩蔽抗體

全長IgG具有血清半衰期長、腎或肝膽清除有限以及免疫原性低的優(yōu)點。然而，與此形成鮮明對比的是，單鏈Fv、Fabs和其他較小的抗體支架仍然是臨床階段免疫毒素的主力，這些免疫毒素使用基于蛋白質(zhì)的毒素作為細胞毒性部分。靶向CD22和CD25的免疫毒素在不同類型的白血病早期臨床研究中顯示出持久的反應(yīng)。較小的支架可以改善通常受擴散限制的腫瘤滲透?？贵w的擴散性被認為與大小成反比，因此單鏈可變區(qū)片段抗體相對于全長抗體具有約六倍的優(yōu)勢。此外，較小的結(jié)構(gòu)可以為定點偶聯(lián)提供更多機會。

這些構(gòu)建體包括scFvs、雙特異性抗體、Fabs和同源二聚體單鏈抗體。在每種情況下，都是通過表面暴露的半胱氨酸殘基實現(xiàn)定點偶聯(lián)。Perrino等人測試了一種名為SIP(F8)-SS-DM1的ADC，其中抗體成分是一個靶向纖連蛋白剪接變體的同源二聚體"小免疫蛋白"。該ADC是一種非內(nèi)化ADC，設(shè)計用于結(jié)合腫瘤血管系統(tǒng)中的EDA，并在二硫鍵還原后在局部釋放高濃度DM1。在F9畸胎癌小鼠模型中，7 mg/kg q3dx3方案的耐受性良好，并伴有腫瘤完全消退。

在大多數(shù)情況下，實體瘤ADC面臨著靶點在正常組織上表達的挑戰(zhàn)。正常組織的表達可能導(dǎo)致劑量限制性的靶上毒性，或通過增加ADC在腫瘤外的攝取和有效載荷釋放而導(dǎo)致脫靶毒性。Probody?技術(shù)為緩解此問題提供了一種方法。在Probody中，抗體輕鏈被修飾成包含一個氨基末端掩蔽肽和蛋白酶可裂解的連接子。掩蔽肽旨在阻斷正常組織中的抗原結(jié)合，但在腫瘤微環(huán)境中被蛋白酶釋放。在小鼠EGFR表達異種移植瘤模型中，野生型和Probody形式的西妥昔單抗顯示出相似的抗腫瘤療效。然而，在非人靈長類動物中，Probody顯示出更好的安全性和循環(huán)半衰期。

3.5 ADC在腫瘤學(xué)以外適應(yīng)癥的應(yīng)用

除了Adcetris?在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的探索性II期研究外，所有臨床階段的ADC都攜帶用于癌癥治療的細胞毒性有效載荷。從概念上講，細胞毒性ADC可以更廣泛地開發(fā)用于腫瘤學(xué)以外的用途，之前在炎癥、感染和眼部疾病中對免疫毒素的臨床評估為此提供了先例。然而，更重要的是，抗體有潛力特異性遞送其他類別的藥物，同樣的原理適用于將高活性化合物特異性遞送至目標(biāo)細胞，同時最大限度地減少對非靶細胞和組織的不良影響。為此，臨床前研究評估了靶向CD163+巨噬細胞的地塞米松、靶向人類免疫缺陷病毒的CCR5拮抗劑、靶向CXCR4+造血細胞的多激酶抑制劑達沙替尼以及靶向CD11a+巨噬細胞的LXR激動劑。

達沙替尼（圖10）通過抑制bcr-abl激酶，用于治療費城染色體陽性白血病。達沙替尼還抑制其他幾種激酶，包括介導(dǎo)T細胞信號傳導(dǎo)的src家族成員lck和fyn。然而，作為游離藥物的達沙替尼的副作用譜阻礙了其作為免疫抑制劑的評估。CXCR4是一種趨化因子受體，在多種造血和非造血細胞類型上表達。Wang等人使用基于二硫鍵和非裂解連接子（DAR約3）將達沙替尼與抗CXCR4和對照抗體偶聯(lián)。測試了這些ADC在抗CD3/抗CD28抗體刺激下對原代人T細胞分泌TNF-α和IL-2的影響?？闪呀獾目笴XCR4 ADC在13-27 nM濃度下阻斷50%的細胞因子分泌，而非結(jié)合ADC在200 nM時影響甚微。同樣，未偶聯(lián)的抗體和游離藥物-連接子在300 nM濃度下均無活性。需要進一步研究以表征這些ADC在相關(guān)疾病模型中的安全性和有效性。

圖10 達沙替尼及其可裂解的基于達沙替尼的抗CXCR4 ADC的結(jié)構(gòu)（用于靶向免疫抑制）

基于LXR激動劑在促進巨噬細胞膽固醇流出方面的有益作用，人們一直在探索將其用于動脈粥樣硬化治療。然而，這些藥物在肝臟中的不良靶向效應(yīng)阻礙了其臨床開發(fā)。為了賦予巨噬細胞特異性，Lim等人將一種強效LXR激動劑與抗CD11a抗體偶聯(lián)。CD11a是整合素LFA-1的α亞基，在單核細胞、巨噬細胞和其他白細胞上廣泛表達。如前所述，有效載荷通過定點特異性方式與已工程化含有非天然氨基酸pAcF的抗CD11a和對照抗體偶聯(lián)。與非結(jié)合對照ADC不同，抗CD11a ADC（圖11）特異性結(jié)合并被CD11a+ THP-1單核細胞（而非CD11a- HepG2肝癌細胞）內(nèi)化?？笴D11a ADC在THP-1（而非HepG2）報告細胞系中誘導(dǎo)了LXR驅(qū)動的熒光素酶表達，而游離藥物在兩系中均有活性。

圖11 抗CD11a- LXR 激動劑抗體偶聯(lián)藥物（ADC）結(jié)構(gòu)示意圖

4 結(jié)論

抗體工程和藥物-連接子設(shè)計的單獨和協(xié)同創(chuàng)新，已在臨床前模型中顯著提高了腫瘤靶向ADC的活性廣度和治療窗口。另外，未來的方向可能包括增強效力、選擇性或內(nèi)化的雙特異性ADC、攜帶多類藥物的ADC。此外，藥物分子可以被設(shè)計為在細胞外發(fā)揮作用，以實現(xiàn)靶向特異性或調(diào)節(jié)受體活性。ADC技術(shù)的快速發(fā)展與優(yōu)化，為改善多種人類疾病的治療提供了新的方案。

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