近年來，以 mRNA 疫苗為代表的脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles, LNP）遞送體系推動了核酸藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用。LNP 具有良好的生物相容性和封裝效率，已在肝臟疾病和感染性疾病治療中顯示突出優(yōu)勢。然而，在實體瘤等復(fù)雜疾病環(huán)境中，LNP 介導(dǎo)的核酸遞送仍面臨關(guān)鍵瓶頸——腫瘤細(xì)胞對 LNP 的攝取效率普遍較低，導(dǎo)致有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的核酸劑量受限，從而削弱治療效應(yīng)。已有研究利用基因組范圍的 CRISPR 篩選鑒定了維持納米顆?；A(chǔ)攝取的重要通路，如內(nèi)吞與胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)?。但迄今為止，更多工作聚焦于“哪些基因缺失會讓攝取變差”，而對于“抑制哪些基因能夠增強(qiáng)納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞、并能否利用藥物進(jìn)一步增強(qiáng)這一效果”，了解仍然有限。

近日， 美國西北大學(xué)及 陳-扎克伯格 生物中心 的王宗杰團(tuán)隊在Advanced Science在線發(fā)表題為

Genome-Wide CRISPR Screen Reveals PIK3CA Inhibition Enhances Lipid Nanoparticle-Mediated siRNA Delivery

為了系統(tǒng)尋找調(diào)控 LNP 攝取的基因，研究團(tuán)隊在結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SW480 中，引入了全基因組 CRISPR 敲除文庫。隨后，研究者使用一款具有臨床可轉(zhuǎn)化潛力的 siRNA-LNP 體系：采用與獲批藥物 Patisiran 類似的 MC3 配方，通過 NanoGenerator Flex-M 平臺制備標(biāo)準(zhǔn)化 LNP，并封裝帶有 FAM 熒光標(biāo)記的對照 siRNA。在 LNP 處理細(xì)胞后，團(tuán)隊根據(jù) FAM 熒光強(qiáng)度使用流式細(xì)胞術(shù)將細(xì)胞分為“高攝取（FAM-high）”和“低攝?。‵AM-low）”兩個亞群，并分別進(jìn)行文庫富集分析。通過比較兩組細(xì)胞中 sgRNA 的富集情況，研究者得以繪制出影響 LNP 攝取的基因全景圖。

這一篩選不僅驗證了已知的內(nèi)吞和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)通路在 LNP 遞送中的重要性，也識別出一批此前未充分關(guān)注的“正/負(fù)調(diào)控因子”。其中，PIK3CA 作為 PI3Kα 通路核心基因之一，在“敲除后顯著增強(qiáng) LNP 攝取”的候選基因中位居前列，并且具有現(xiàn)成的小分子抑制劑進(jìn)入過臨床開發(fā)階段，因此被鎖定為后續(xù)重點(diǎn)研究的“可藥物化”靶點(diǎn)。

為了驗證 PIK3CA 在 LNP 攝取中的功能，研究人員一方面利用 CRISPR 敲除和 siRNA 下調(diào) PIK3CA 表達(dá)，另一方面則采用藥理學(xué)方法抑制其活性。研究中選用的 BAY1082439 是一款選擇性 PI3Kα 抑制劑，曾在臨床環(huán)境中進(jìn)行評估。在細(xì)胞實驗中，研究者首先用不同小分子預(yù)處理癌細(xì)胞，再給予固定配方和劑量的 FAM 或 Cy5 標(biāo)記 siRNA-LNP，隨后通過流式和熒光顯微鏡評估細(xì)胞對 LNP 的攝取情況。結(jié)果顯示，針對 PIK3CA 的 BAY1082439 能顯著提高細(xì)胞中 LNP 相關(guān)熒光信號的陽性比例和熒光強(qiáng)度，提示 LNP 攝取明顯增強(qiáng) 。 從熒光流式峰圖到顯微鏡圖像，多種 結(jié)果 一致指向同一結(jié)論：抑制 PIK3CA 能夠使更多 LNP 進(jìn)入細(xì)胞，從而為后續(xù) siRNA 遞送和功能沉默打下基礎(chǔ)。

LNP 最終的目標(biāo)不是進(jìn)入細(xì)胞本身，而是有效釋放 siRNA 實現(xiàn)靶基因沉默，從而產(chǎn)生抗腫瘤等治療效應(yīng)。為此，研究團(tuán)隊進(jìn)一步評估了 PIK3CA 抑制對功能性 siRNA-LNP 的影 響。在體外實驗中，研究者選擇 KRAS 依賴性的結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SW480 和 SW620，使用封裝 KRAS 靶向 siRNA 的 LNP 進(jìn)行處理。單獨(dú)使用 KRAS siRNA-LNP 即可在一定程度上降低細(xì)胞中突變 KRAS 的表達(dá)并抑制細(xì)胞生長。而當(dāng)與 BAY1082439 聯(lián)合使用時，KRAS 表達(dá)下調(diào)程度顯著加深，細(xì)胞凋亡和增殖抑制效應(yīng)也更為明顯。類似的增強(qiáng)效應(yīng)并不限于 KRAS 靶點(diǎn)，針對其他功能基因（如 KDM4A、KIF11、Bid）的 siRNA-LNP 在 PIK3CA 抑制背景下，同樣表現(xiàn)出更強(qiáng)的基因沉默和細(xì)胞毒性效果。這表明，調(diào)控宿主細(xì)胞的 PIK3CA 通路有望作為一種普適策略，用于放大多種 siRNA-LNP 組合的功能。值得一提的是，研究者還在多種不同來源的上皮癌細(xì)胞系中（包括肺癌細(xì)胞 NCI-H441、乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 等）評估這一組合策略。結(jié)果顯示，BAY1082439 聯(lián)合 siRNA-LNP 在多種細(xì)胞模型中均能提高 LNP 攝取和靶基因沉默效率，提示該策略具有跨腫瘤類型的廣泛適用性。

為了驗證這一策略在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化潛力，研究團(tuán)隊在小鼠腫瘤模型中聯(lián)合使用 BAY1082439 與 siRNA-LNP。研究者選用含 KRAS 突變的腫瘤細(xì)胞構(gòu)建異種移植模型，并在一定治療窗口期內(nèi)給予不同處理組合。與單用 siRNA-LNP 相比，聯(lián)合 PIK3CA 抑制劑的治療組在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出更顯著的腫瘤生長抑制，腫瘤體積和重量均明顯降低。更重要的是，聯(lián)合用藥在達(dá)到相似甚至更佳抗腫瘤效果的同時，可以在一定程度上降低所需 LNP 劑量，從而減輕與 LNP 相關(guān)的肝臟炎癥反應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)提示，通過調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)信號通路提升遞送效率，有望在“增強(qiáng)療效”和“改善安全性”之間取得新的平衡。

本研究提出了一個新理念 是將功能基因組學(xué)與納米藥物遞送相結(jié)合，既關(guān)注納米顆粒本身的配方與結(jié)構(gòu)，也系統(tǒng)探索靶細(xì)胞內(nèi)有哪些可被利用的“調(diào)控開關(guān)”。傳統(tǒng) 研究而言 ，提升納米藥物遞送效率的主要思路，是通過化學(xué)改性或物理手段優(yōu)化載體本身的性質(zhì)，例如改變粒徑、電荷、表面修飾等。本研究則提出一個互補(bǔ)視角：通過 CRISPR 篩選尋找“promoter genes”——那些在被抑制或敲除后可以增強(qiáng)納米顆粒攝取的基因，再通過小分子藥物等手段靶向調(diào)控這些基因，從而提升 LNP 進(jìn)入細(xì)胞的能力。在這一框架下，PIK3CA 被證明是一個具有代表性的“宿主調(diào)控靶點(diǎn)”。利用現(xiàn)有已進(jìn)入臨床開發(fā)階段的 PI3Kα 抑制劑，就有可能在不改變 LNP 配方的情況下，實現(xiàn)對多種 siRNA-LNP 遞送效率的整體“加速”，這為未來 RNA 干擾藥物在實體瘤等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的組合思路。

總體而言，這項工作通過全基因組 CRISPR 篩選，系統(tǒng)繪制了 LNP 攝取的遺傳調(diào)控圖譜，發(fā)現(xiàn) PIK3CA 是一個可藥物靶向的重要負(fù)調(diào)控因子。藥理學(xué)抑制 PIK3CA 能夠顯著增強(qiáng)多種上皮癌細(xì)胞中 LNP 的攝取、siRNA 的遞送和基因沉默效率，并在小鼠腫瘤模型中提高抗腫瘤療效、減輕肝臟炎癥。 這項工作不僅為提升 LNP 介導(dǎo)的 RNA 干擾治療提供了可快速轉(zhuǎn)化的策略，也展示了“功能基因組學(xué) × 納米醫(yī)學(xué)”的強(qiáng)大潛力。未來，隨著更多宿主調(diào)控靶點(diǎn)的鑒定，這種“優(yōu)化顆粒 + 調(diào)控細(xì)胞”的組合策略，有望推動精準(zhǔn)納米藥物在實體瘤等重大疾病中的臨床應(yīng)用。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202517617

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