北京時(shí)間12月19日，南方科技大學(xué)鄢仁鴻課題組聯(lián)合華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亓文寶團(tuán)隊(duì)，在非洲豬瘟病毒（ASFV）研究領(lǐng)域取得重要進(jìn)展。相關(guān)研究成果以Structural basis for DNA replication by the African Swine Fever Virus polymerase為題，于同日在線發(fā)表于Cell子刊

iScience

非洲豬瘟是由ASFV引起的豬烈性傳染病，具有高致死率，自2018年傳入我國以來，已造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)安全。由于ASFV基因組龐大復(fù)雜，編碼蛋白眾多，且缺乏有效抗病毒藥物和商業(yè)化疫苗，其防控一直是全球獸醫(yī)領(lǐng)域的重大難題。病毒DNA聚合酶作為基因組復(fù)制的核心“引擎”，是抗病毒藥物開發(fā)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，但ASFV的DNA聚合酶的復(fù)制機(jī)制此前尚未被完全解析。

研究團(tuán)隊(duì)通過基因編輯技術(shù)構(gòu)建系列Pol β突變體病毒，發(fā)現(xiàn)無論是完全敲除Pol β基因，還是截短其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，均會(huì)顯著抑制ASFV的正常增殖。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，Pol β在感染細(xì)胞中特異性定位于病毒復(fù)制工廠，與病毒DNA精準(zhǔn)共定位，直接參與基因組合成過程，明確了其作為病毒復(fù)制關(guān)鍵蛋白的重要地位。為闡明Pol β的工作機(jī)制，團(tuán)隊(duì)利用高分辨率冷凍電鏡技術(shù)，成功解析了Pol β截短體（Pol β-ΔC）的三種關(guān)鍵構(gòu)象結(jié)構(gòu)——兩種apo態(tài)（分辨率2.92 ?、2.93 ?）和一種dsDNA結(jié)合的活性態(tài)（分辨率2.53 ?）。結(jié)構(gòu)分析顯示，Pol β包含N端結(jié)構(gòu)域、核酸外切酶域(Exo)及聚合酶核心域（Palm、Finger、Thumb）。其Thumb結(jié)構(gòu)域在apo態(tài)中呈現(xiàn)“開放-閉合”動(dòng)態(tài)變化，而結(jié)合dsDNA后會(huì)發(fā)生顯著構(gòu)象翻轉(zhuǎn)，與Finger結(jié)構(gòu)域協(xié)同包裹DNA底物，形成活性催化中心 (圖1)。

圖1 冷凍電鏡解析的非洲豬瘟病毒DNA聚合酶apo狀態(tài)與DNA結(jié)合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)

此外，該研究首次發(fā)現(xiàn)，Pol β結(jié)合DNA后可形成四聚體復(fù)合物，通過結(jié)構(gòu)分析鑒定出R875、E877、Q878等關(guān)鍵寡聚化相互作用位點(diǎn)。當(dāng)這些位點(diǎn)突變后，Pol β的四聚體形成能力喪失，其DNA延伸活性下降超過80%，表明這種寡聚化狀態(tài)是其發(fā)揮催化活性的必要條件（圖2）。

圖2 寡聚化對非洲豬瘟病毒DNA聚合酶活性至關(guān)重要

該研究還通過結(jié)構(gòu)比對發(fā)現(xiàn)，ASFV Pol β與猴痘病毒DNA聚合酶具有約23%的序列相似性，但在構(gòu)象靈活性上存在顯著差異——Pol β通過自身動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化即可完成底物結(jié)合與催化調(diào)控，而猴痘病毒聚合酶則更依賴輔助蛋白組裝復(fù)合物。分子對接分析進(jìn)一步指出，核苷類似物CDVpp和Ara-CTP可能作為潛在的競爭性抑制劑，為后續(xù)藥物設(shè)計(jì)提供了線索。此外，研究發(fā)現(xiàn)ASFV Pol β-ΔC的持續(xù)合成能力有限，在單輪復(fù)制中延伸引物通常少于38個(gè)核苷酸，這與其在病毒工廠內(nèi)可能需要輔助蛋白（如PCNA）協(xié)作的高效復(fù)制模式形成對比，揭示了其獨(dú)特的復(fù)制策略和可干預(yù)環(huán)節(jié)。

南方科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院鄢仁鴻副教授、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黃麗紅及亓文寶教授為該論文的共同通訊作者。南方科技大學(xué)博士生胡紫薇、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士生孫康永杰為本文共同第一作者。研究得到了國家自然科學(xué)基金、深圳醫(yī)學(xué)研究基金、廣東省重大基礎(chǔ)研究項(xiàng)目等資助，并依托南方科技大學(xué)冷凍電鏡中心完成。該研究系統(tǒng)闡釋了ASFV DNA聚合酶的工作機(jī)制，為抗非洲豬瘟藥物的理性設(shè)計(jì)提供了全新的靶點(diǎn)與結(jié)構(gòu)模板，有望推動(dòng)非洲豬瘟防控從“被動(dòng)撲殺”向“主動(dòng)干預(yù)”轉(zhuǎn)變，具有重要的科學(xué)價(jià)值與應(yīng)用前景。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004225024162

文章轉(zhuǎn)載 自鄢仁鴻課題組