撰文|亦

先天性魚鱗病（Autosomal recessive congenital ichthyosis ，ARCI）目前缺乏有效治療手段，現(xiàn)有療法主要依賴耗時的癥狀管理（如每日長時間護(hù)理、系統(tǒng)性維A酸使用）【1，2】，無法根治疾病。近年來，基于基因增強(qiáng)和蛋白質(zhì)替代的策略雖有一定進(jìn)展，但多采用病毒或非病毒載體進(jìn)行遞送【3，4】，存在免疫原性高、包裝能力有限、易引發(fā)插入突變或基因表達(dá)失調(diào)等問題。CRISPR基因編輯技術(shù)的發(fā)展為精準(zhǔn)糾正致病突變提供了新可能，但目前在皮膚疾病領(lǐng)域的應(yīng)用仍多局限于細(xì)胞模型或動物實(shí)驗(yàn)【5，6】，缺乏針對人類皮膚復(fù)雜結(jié)構(gòu)與屏障功能的原位編輯策略，且病毒載體的長期表達(dá)特性不利于基因編輯的安全性控制。因此，亟需開發(fā)一種安全、高效、可局部遞送的非病毒基因編輯系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對人皮膚疾病的原位糾正。

2026年1月27 日，柏林健康研究所Sarah Hedtrich團(tuán)隊(duì)在Cell Stem Cell上發(fā)表題為LNP-based non-viral in situ gene editing of the congenital ichthyosis-causing mutations in human skin models的文章。提出 一種基于激光輔助的脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)，用于在人類皮膚模型中原位糾正導(dǎo)致ARCI的TGM1 c.877-2A>G剪接位點(diǎn)突變，并在體內(nèi)外都證實(shí)了該LNP系統(tǒng)的良好安全性、低免疫原性及無系統(tǒng)性分布特性 。

精確糾正TGM1剪接位點(diǎn)突變c.877-2A>G 的 挑戰(zhàn)在于目標(biāo)堿基旁存在一個關(guān)鍵的“旁觀者”核苷酸，若被編輯會產(chǎn)生非功能序列。為此，研究比較了標(biāo)準(zhǔn)編輯器BE4max與兩種新一代窄窗口編輯器eTD-CBE和eA3G-CBE，并優(yōu)化了總RNA劑量及mRNA/sgRNA比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， eTD-CBE在目標(biāo)位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了最高約26%的編輯效率，且完全避免了旁觀者編輯 。 而總RNA劑量在3-10 μg時編輯效率達(dá)到平臺期，更高的sgRNA比例雖略微提升編輯但伴隨細(xì)胞毒性 。這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)選定了eTD-CBE作為最佳編輯器并確定了安全的RNA劑量范圍。

為了在模擬人類皮膚組織復(fù)雜結(jié)構(gòu)的模型中評估基因編輯療效，研究利用攜帶TGM1突變的患者細(xì)胞構(gòu)建了3D ARCI皮膚疾病模型。通過免疫熒光、屏障滲透實(shí)驗(yàn)、原位酶活染色及蛋白質(zhì)組學(xué)分析，系統(tǒng)比較了正常與ARCI模型的表型差異。結(jié)果證實(shí)，ARCI模型表皮分化受損（filaggrin、involucrin等標(biāo)志物表達(dá)降低）、組織結(jié)構(gòu)紊亂、皮膚屏障功能缺陷，并且完全喪失了TG1酶活性，蛋白質(zhì)組學(xué)也顯示TGM1、KRT10等屏障相關(guān)蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，成功模擬了疾病的關(guān)鍵病理特征。

為了克服皮膚角質(zhì)層對生物大分子的遞送屏障，研究將臨床已批準(zhǔn)的激光微消融技術(shù)與反射共聚焦顯微鏡結(jié)合，在皮膚上制造精確深度的微孔以遞送LNP。通過劑量反應(yīng)曲線確定在人類皮膚和ARCI模型中， 7 μg總RNA可實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的原位編輯效率 （約7.36%和平均12%的基因糾正）。重要的是， 在該劑量下未檢測到旁觀者編輯，且脫靶編輯分析（包括NGS、CAST-seq和R-loop assay）顯示編輯特異性極高，僅在一個非編碼區(qū)檢測到<1%的極低水平離靶事件 。功能上， 3 μg總RNA處理即可最高效地恢復(fù)TG1酶活性 ，蛋白質(zhì)組學(xué)分析也證實(shí)了全長TGM1蛋白的表達(dá)及相關(guān)皮膚分化標(biāo)志物的有益變化。

鑒于皮膚是高免疫原性器官，還需要評估LNP制劑在皮膚相關(guān)免疫細(xì)胞和新鮮人皮膚組織中的免疫激活潛力。研究用不同載藥（如未修飾mRNA、修飾mRNA、RNP）和不同脂質(zhì)組成的LNP刺激人單核細(xì)胞源性樹突狀細(xì)胞（MoDCs），并以COVID-19 mRNA疫苗和病毒載體疫苗為參照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 載有RNP或未修飾mRNA的DOPE-LNP能顯著上調(diào)MoDCs的MHC II類及CD40/CD86共刺激分子表達(dá)，而本研究的主導(dǎo)LNP H制劑即使載有未修飾mRNA也未引發(fā)顯著免疫反應(yīng)。將LNP局部應(yīng)用于新鮮人皮膚后，也未觀察到遷移免疫細(xì)胞激活或促炎細(xì)胞因子釋放，表明LNP H具有優(yōu)異的免疫相容 。

為全面評估原位基因編輯療法的安全性，尤其是局部給藥后LNP及其載體的全身生物利用度，研究在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了毒性實(shí)驗(yàn)。通過調(diào)整激光參數(shù)和設(shè)計針對小鼠Tgm1同源序列的sgRNA，評估了單次和重復(fù)給藥（最高30 μg RNA/只）后的局部耐受性、全身毒性及器官分布。結(jié)果顯示，治療未引起小鼠死亡、體重變化或局部皮膚刺激，組織學(xué)檢查也未發(fā)現(xiàn)中度或強(qiáng)烈的局部免疫反應(yīng)或白細(xì)胞浸潤?；铙w成像和DESI-MSI代謝成像分析證實(shí)，熒光信號和LNP特異性脂質(zhì)離子僅存在于處理部位的皮膚中，在心、肝、脾、肺等其他器官均未檢測到顯著積累，表明 LNP及其遺傳貨物無全身性分布，具有良好的局部安全性 。

總的來說， 本研究成功開發(fā)了一種基于激光輔助、非病毒LNP遞送的原位基因編輯策略，在高度模擬人體皮膚結(jié)構(gòu)的三維ARCI疾病模型中，實(shí)現(xiàn)了對最常見致病突變TGM1 c.877-2A>G的高效、精準(zhǔn)糾正，并恢復(fù)了約30%的TG1功能酶活。安全性評估表明，該LNP系統(tǒng)具有極低的免疫原性、優(yōu)異的局部耐受性，且無全身性分布風(fēng)險。 這項(xiàng)研究首次在人類皮膚疾病模型中完成了從突變糾正到功能恢復(fù)的全鏈條驗(yàn)證，不僅為目前缺乏根治手段的先天性魚鱗病提供了首個潛在治愈性療法方案，更建立了一個安全、微創(chuàng)、可局部應(yīng)用的基因編輯技術(shù)平臺，為治療其他遺傳性皮膚病乃至需要局部精準(zhǔn)遞送的基因治療領(lǐng)域，開辟了全新的轉(zhuǎn)化路徑。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2026.01.001

制版人： 十一

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