摘要：CHO細(xì)胞是生物制藥中重組蛋白生產(chǎn)的核心宿主，但宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）作為工藝雜質(zhì)，會(huì)增加下游純化成本、影響產(chǎn)品安全性。本研究通過蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出高豐度、難去除的HCPs，利用CRISPR多重基因敲除技術(shù)，在CHO細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了最多11個(gè)HCP相關(guān)基因的敲除，最終使分泌型HCPs水平降低57%~85%，且未損害細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)率，其中纖連蛋白1（FN1）敲除還能顯著提升培養(yǎng)性能，為生物制藥高效、清潔生產(chǎn)提供了全新的工程化CHO細(xì)胞底盤。

一、CHO細(xì)胞的“雜質(zhì)痛點(diǎn)”，生物制藥的卡脖子難題

作為重組治療性蛋白生產(chǎn)的主力軍，CHO細(xì)胞憑借高產(chǎn)能、人源化翻譯后修飾等優(yōu)勢(shì)，支撐了絕大多數(shù)獲批生物藥的生產(chǎn)。但生產(chǎn)過程中釋放的宿主細(xì)胞蛋白（HCPs），是最頭疼的工藝相關(guān)雜質(zhì)。這些蛋白不僅會(huì)給細(xì)胞帶來代謝負(fù)擔(dān)，還會(huì)增加下游純化的難度和成本，微量殘留甚至可能影響藥物穩(wěn)定性、引發(fā)患者免疫反應(yīng)，成為生物制藥生產(chǎn)的一大痛點(diǎn)。傳統(tǒng)下游純化能去除大部分HCPs，卻對(duì)部分高豐度、難清除的HCPs束手無策，從上游改造細(xì)胞減少HCPs，成了行業(yè)的重要研究方向。

二、精準(zhǔn)定位！找出該敲除的“問題HCPs”

要改造細(xì)胞，首先得找準(zhǔn)目標(biāo)。研究團(tuán)隊(duì)對(duì)不同克隆、不同產(chǎn)品的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清，以及下游純化各步驟的樣品做了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，用LC–MS/MS鑒定出1254種HCPs，最終篩選出67種“核心HCPs”——它們僅占總種類的5%，卻貢獻(xiàn)了63%的總HCP質(zhì)量，是代謝負(fù)擔(dān)的主要來源。

同時(shí)團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Protein A捕獲、離子交換層析等標(biāo)準(zhǔn)純化步驟后，仍有PRDX1、CLU等HCPs持續(xù)殘留，這類難去除的蛋白也被納入敲除候選名單。結(jié)合能量成本分析和純化持久性，研究最終確定了71個(gè)HCP相關(guān)候選基因，為后續(xù)敲除篩選打下基礎(chǔ)。

三、層層篩選！62個(gè)基因里挑出36個(gè)“安全敲除靶點(diǎn)”

確定候選基因后，團(tuán)隊(duì)用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過混合敲除和單細(xì)胞敲除兩種方式，對(duì)62個(gè)可實(shí)驗(yàn)的候選基因進(jìn)行篩選（9個(gè)因技術(shù)問題未評(píng)估）。研究設(shè)置了嚴(yán)格的篩選標(biāo)準(zhǔn)：敲除后細(xì)胞需保持正常的生長(zhǎng)活力和蛋白產(chǎn)率，且敲除效率穩(wěn)定（傳代過程中敲除評(píng)分漂移不超過10%）。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，部分基因如GAPDH、EEF1A1是細(xì)胞必需的，敲除后細(xì)胞無法存活或增殖受阻；而另一部分基因敲除后，細(xì)胞性能未受影響甚至提升。最終從62個(gè)基因中，篩選出36個(gè)適合進(jìn)行宿主細(xì)胞簡(jiǎn)化的有效靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)敲除后不會(huì)對(duì)CHO細(xì)胞的核心生產(chǎn)性能造成負(fù)面影響。

四、意外驚喜！FN1敲除，既減雜質(zhì)又提生產(chǎn)性能

在篩選過程中，纖連蛋白1（FN1）敲除成為最大的驚喜。團(tuán)隊(duì)將FN1敲除引入4個(gè)不同的NISTmAb生產(chǎn)CHO克隆，發(fā)現(xiàn)敲除后細(xì)胞的培養(yǎng)穩(wěn)定期顯著延長(zhǎng)，活力下降速度明顯放緩，葡萄糖代謝和乳酸分泌卻未發(fā)生明顯變化。

這種表型直接帶來了生產(chǎn)效益的提升：FN1敲除株的積分活細(xì)胞濃度（IVCC）更高，培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)，最終重組蛋白滴度平均提升30%以上。這一效果在不同克隆中均能重現(xiàn)，說明FN1敲除是提升CHO細(xì)胞生產(chǎn)性能的通用策略，也讓其成為后續(xù)多重敲除的核心靶點(diǎn)之一。

五、多重敲除！7基因編輯實(shí)現(xiàn)58% HCPs降低

基于篩選出的靶點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)率先開展了7重基因敲除，靶向BGN、FN1、LPL等7個(gè)高豐度/難去除的HCP相關(guān)基因，這些基因?qū)?yīng)的蛋白約占總HCP質(zhì)量的15%。通過CRISPR RNP復(fù)合物共轉(zhuǎn)染，獲得了敲除效率均超80%的細(xì)胞池，經(jīng)單細(xì)胞克隆后，得到了4重至7重敲除的不同克隆株。

7重敲除株在補(bǔ)料分批培養(yǎng)中，展現(xiàn)出和FN1單敲除相似的延長(zhǎng)穩(wěn)定期表型，且在培養(yǎng)第7天，分泌型HCPs水平較野生型降低58%，遠(yuǎn)高于預(yù)期的15%。這說明多重敲除不僅能直接去除靶向蛋白，還會(huì)通過干擾細(xì)胞外基質(zhì)分泌等途徑，間接減少其他HCPs的釋放，產(chǎn)生“疊加效應(yīng)”。

六、升級(jí)改造！11重敲除將HCPs降低至85%

在7重敲除的基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊(duì)以高產(chǎn)能的6重敲除克隆為底盤，繼續(xù)敲除HSP90AA1、CLU等4個(gè)基因，實(shí)現(xiàn)了11重基因敲除，其中CLU還是典型的難去除HCPs。盡管因2個(gè)靶點(diǎn)敲除效率稍低，僅獲得4株純合11重敲除克隆，但這些克隆仍保持了良好的細(xì)胞活力。

培養(yǎng)第11天，11重敲除細(xì)胞池的HCPs水平較野生型降低85%，敲除克隆也實(shí)現(xiàn)了57%的降低，且部分克隆仍保持了較高的重組蛋白產(chǎn)率。這一結(jié)果證實(shí)，CHO細(xì)胞能耐受至少11個(gè)HCP相關(guān)基因的敲除，多重基因編輯的策略具有良好的可擴(kuò)展性。

七、研究啟示，清潔CHO細(xì)胞的未來應(yīng)用

這項(xiàng)研究的成果，為生物制藥生產(chǎn)帶來了多重價(jià)值。首先，上游基因編輯從源頭減少HCPs，能大幅降低下游純化的壓力，甚至可能簡(jiǎn)化純化步驟，降低生產(chǎn)總成本；其次，F(xiàn)N1等基因的敲除，實(shí)現(xiàn)了“減雜質(zhì)+提產(chǎn)率”的雙重效果，讓工程化CHO細(xì)胞的生產(chǎn)效率更高；另外，敲除株保留了CHO細(xì)胞的核心生產(chǎn)特性，能適配現(xiàn)有工業(yè)生產(chǎn)平臺(tái)，產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化的難度較低。

當(dāng)然研究也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)后期的細(xì)胞裂解會(huì)釋放胞內(nèi)蛋白，抵消部分敲除帶來的HCPs降低效果。后續(xù)可結(jié)合早收獲工藝或抗凋亡基因編輯，進(jìn)一步減少后期HCPs的釋放。而此次篩選出的36個(gè)安全靶點(diǎn)，也為后續(xù)開發(fā)更優(yōu)的清潔CHO底盤細(xì)胞，提供了豐富的基因編輯組合選擇。

八、總結(jié)

從蛋白質(zhì)組學(xué)精準(zhǔn)篩靶，到CRISPR多重基因編輯，這項(xiàng)研究成功打造了一款“清潔型”CHO細(xì)胞底盤，通過最多11個(gè)基因的敲除，實(shí)現(xiàn)了HCPs水平57%~85%的降低，且未犧牲細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)率，還意外發(fā)現(xiàn)FN1敲除能顯著提升生產(chǎn)性能。這一研究不僅為解決生物制藥的HCPs雜質(zhì)難題提供了全新方案，也為CHO細(xì)胞的理性工程化改造提供了重要的靶點(diǎn)庫和技術(shù)思路，未來隨著技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，清潔CHO細(xì)胞有望成為生物制藥生產(chǎn)的新一代核心宿主，推動(dòng)行業(yè)向更高效、更清潔、更安全的方向發(fā)展。

識(shí)別微信二維碼，添加抗體圈小編，符合條件者即可加入抗體圈微信群！

請(qǐng)注明：姓名+研究方向！

本公眾號(hào)所有轉(zhuǎn)載文章系出于傳遞更多信息之目的，且明確注明來源和作者，不希望被轉(zhuǎn)載的媒體或個(gè)人可與我們聯(lián)系(cbplib@163.com)，我們將立即進(jìn)行刪除處理。所有文章僅代表作者觀點(diǎn)，不代表本站立場(chǎng)。