近日，高致病性病毒與生物安全全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/泰康生命醫(yī)學(xué)中心藍(lán)柯研究組在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Journal of Virology發(fā)表了題為Repression of EEF1D by KSHV RTA Promotes Viral Lytic Reactivation的研究論文。該研究揭示了卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）裂解復(fù)制開(kāi)關(guān)分子RTA作為轉(zhuǎn)錄抑制因子下調(diào)宿主抗病毒蛋白EEF1D從而促進(jìn)病毒裂解復(fù)制的新機(jī)制。

卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV），又稱人類皰疹病毒 8 型（HHV-8），是導(dǎo)致卡波西肉瘤（KS）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤（PEL）和多中心卡斯特曼?。∕CD）的主要病原體。KSHV 在宿主體內(nèi)主要以潛伏感染（Latency）狀態(tài)存在，此時(shí)病毒基因組保持靜默，僅表達(dá)極少數(shù)基因以逃避宿主免疫清除。然而，在特定環(huán)境刺激下，病毒會(huì)進(jìn)入裂解性激活（Lytic Reactivation）階段。這一過(guò)程對(duì)于病毒的水平傳播及致病性至關(guān)重要，因?yàn)榇罅康牟《绢w粒產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解和炎癥反應(yīng)。這一轉(zhuǎn)變的“總開(kāi)關(guān)”是病毒編碼的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄激活因子（RTA）。雖然 RTA 的促激活作用已被廣泛研究，但宿主細(xì)胞如何通過(guò)限制 RTA 的功能來(lái)維持潛伏狀態(tài)，以及 RTA 如何反過(guò)來(lái)瓦解這些宿主“防御枷鎖”，仍是病毒學(xué)領(lǐng)域的核心課題。
本研究聚焦于真核翻譯延伸因子EEF1D（eukaryotic translation elongation factor 1δ）。傳統(tǒng)上認(rèn)為 EEF1D 參與蛋白質(zhì)合成，但其在病毒生活周期調(diào)節(jié)中的非經(jīng)典功能此前尚不明確。本文采用了分子生物學(xué)、生物化學(xué)與遺傳學(xué)相結(jié)合的多維度實(shí)驗(yàn)方案，即（1）功能篩選與驗(yàn)證： 利用 CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)和過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，觀察 EEF1D 水平變化對(duì) KSHV 裂解基因表達(dá)（如 ORF50/RTA, ORF45, K8）及病毒滴度的影響。（2）蛋白質(zhì)相互作用分析： 通過(guò)共免疫沉淀（Co-IP）和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，檢測(cè) RTA 蛋白與 EEF1D 之間的物理結(jié)合。（3）轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究：采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（Luciferase Assay）和定量 PCR（RT-qPCR），評(píng)估 RTA 是否在轉(zhuǎn)錄水平上抑制 EEF1D基因的啟動(dòng)子活性。（4）蛋白質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：使用蛋白質(zhì)合成抑制劑（放線菌酮，CHX）處理細(xì)胞，觀察 RTA 存在下 EEF1D 蛋白的降解動(dòng)力學(xué)，并利用蛋白酶體抑制劑（MG132）探究其降解途徑。（5）進(jìn)化保守性分析： 對(duì)其他靈長(zhǎng)類（如恒河猴 rKSHV）及嚙齒類（如 MHV-68）的 γ-皰疹病毒同源蛋白進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，分析該機(jī)制的進(jìn)化演變。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，敲除 iSLK-RGB 等細(xì)胞系中的 EEF1D 會(huì)顯著增強(qiáng) KSHV 的裂解性基因表達(dá)，并增加子代病毒的產(chǎn)生。相反，過(guò)表達(dá) EEF1D 則能有效抑制 RTA 誘導(dǎo)的病毒激活。這表明 EEF1D 在生理?xiàng)l件下起到了“分子剎車(chē)”的作用，維持病毒的潛伏狀態(tài)。
研究發(fā)現(xiàn)，KSHV 的 RTA 蛋白演化出了一種極為高效的策略，從兩個(gè)層面清除 EEF1D 的阻礙，即RTA 對(duì) EEF1D 的雙重打擊機(jī)制：

• 轉(zhuǎn)錄抑制：RTA 能夠結(jié)合在 EEF1D 基因的啟動(dòng)子區(qū)域，通過(guò)抑制其轉(zhuǎn)錄活性，從源頭上減少 EEF1D mRNA 的產(chǎn)量。

• 翻譯后降解：RTA 充當(dāng)了 E3 泛素連接酶或其招募者，與 EEF1D 直接結(jié)合并誘導(dǎo)其通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑發(fā)生降解。這是首次證明 RTA 具有靶向降解該類延伸因子的能力。

通過(guò)截短體突變實(shí)驗(yàn)，研究確定了 RTA 的 C 端轉(zhuǎn)錄激活域?qū)ζ湟种?EEF1D 至關(guān)重要。同時(shí)，RTA 的特定基序負(fù)責(zé)與 EEF1D 結(jié)合，這一發(fā)現(xiàn)為未來(lái)篩選阻斷該相互作用的小分子藥物提供了靶點(diǎn)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這種“RTA-EEF1D 拮抗軸”在人類 KSHV 和恒河猴 rKSHV 中高度保守，但在鼠類 γ-皰疹病毒 MHV-68 中并不存在。這暗示該機(jī)制是靈長(zhǎng)類皰疹病毒在長(zhǎng)期進(jìn)化中為了適應(yīng)宿主環(huán)境而獲得的特有策略。

RTA抑制EEF1D以促進(jìn)KSHV裂解復(fù)制的機(jī)制示意圖

由于既往尚沒(méi)有KSHV RTA作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的報(bào)道，團(tuán)隊(duì)深入研究了RTA轉(zhuǎn)錄抑制EEF1D的功能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)這一抑制作用是由RTA通過(guò)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A相互作用，并與另一轉(zhuǎn)錄因子PATZ1形成復(fù)合物，最終由PATZ1將該復(fù)合物招募至EEF1D的啟動(dòng)子區(qū)域從而引起EEF1D啟動(dòng)子超甲基化和轉(zhuǎn)錄抑制。有趣的是，KSHV RTA作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制EEF1D轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象在靈長(zhǎng)類γ皰疹病毒中具有保守性。

總之，該研究首次揭示了KSHV RTA可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子下調(diào)宿主抗病毒蛋白從而促進(jìn)病毒裂解復(fù)制，拓展了對(duì)RTA功能的認(rèn)識(shí)，并為理解KSHV再激活裂解復(fù)制機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士研究生向敏為該論文的第一作者，藍(lán)柯教授為通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。