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Abstract

可持續(xù)性是食品生產(chǎn)領(lǐng)域的一個(gè)主要趨勢(shì)。此外，消費(fèi)者日益要求更安全、加工程度更低的產(chǎn)品。在用于保持新鮮和輕度加工食品的質(zhì)量并延長(zhǎng)其貨架期的不同技術(shù)中，天然抗菌劑提供了一種有前景的策略，可以替代傳統(tǒng)化合物。在這方面，噬菌體裂解蛋白或裂解酶，如內(nèi)裂解酶和病毒體相關(guān)肽聚糖水解酶（VAPGHs），已被提議作為在食品生產(chǎn)鏈中避免和消除不良細(xì)菌的可行選擇。即使這些蛋白是外源性地應(yīng)用，它們也能降解細(xì)菌細(xì)胞壁，同時(shí)保持其裂解活性。這一特性，加上其模塊化的結(jié)構(gòu)（這種結(jié)構(gòu)可以用于生物工程），提供了重要的生物技術(shù)潛力。然而，盡管裂解酶具有潛在的特性，但其商業(yè)化的主要障礙是用于規(guī)范其使用的法律信息有限。這一挑戰(zhàn)突顯了需要探索復(fù)雜的監(jiān)管途徑。本綜述的主要目標(biāo)是解決這一關(guān)鍵差距，并總結(jié)內(nèi)裂解酶在食品生產(chǎn)不同階段中的許多潛在應(yīng)用。通過(guò)這樣做，我們旨在提供對(duì)成功利用溶素必須克服的監(jiān)管挑戰(zhàn)的清晰度和洞察力。

01

Introduction

從全球來(lái)看，世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，不安全的食品每年導(dǎo)致6億例食源性疾病，這些疾病在全球范圍內(nèi)造成42萬(wàn)人死亡。大多數(shù)疫情是由彎曲桿菌、沙門(mén)氏菌以及金黃色葡萄球菌等產(chǎn)生毒素的病原體引起的。這些數(shù)據(jù)突顯了改善我們的抗菌藥物庫(kù)以應(yīng)對(duì)食物中毒的迫切需求。考慮到上述所有內(nèi)容，食品安全研究必須被整合到一個(gè)可持續(xù)發(fā)展框架中，以應(yīng)對(duì)當(dāng)前在實(shí)現(xiàn)糧食安全方面的挑戰(zhàn)。此外，消費(fèi)者要求采用環(huán)保實(shí)踐，同時(shí)保持食品的原有特性。傳統(tǒng)的抗菌方法可能會(huì)影響食品的感官品質(zhì)，甚至降低其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，由于化學(xué)化合物在農(nóng)業(yè)食品生產(chǎn)鏈中釋放殘留物，它們還構(gòu)成了一個(gè)環(huán)境問(wèn)題。此外，農(nóng)業(yè)實(shí)踐中使用的抗生素?cái)?shù)量巨大，加劇了這個(gè)問(wèn)題，因?yàn)榇蟛糠挚股刈罱K通過(guò)排泄物排出，在不同營(yíng)養(yǎng)水平上對(duì)環(huán)境造成損害。這些化合物的普遍使用導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)持續(xù)暴露于抗微生物殘留物中，有時(shí)還會(huì)干擾植物生理機(jī)能。因此，很明顯，應(yīng)限制或控制化學(xué)抗菌劑的使用，優(yōu)先考慮那些對(duì)環(huán)境沒(méi)有有害影響的抗菌劑，如天然抗菌劑。這些天然抗菌劑屬于生物處理范疇，這種處理是基于使用源自有機(jī)體的物質(zhì)。然而，這些化合物既可能自然存在，也可以通過(guò)化學(xué)合成和克隆技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室中人工合成。

在尋找可持續(xù)和自然解決方案以預(yù)防食品被細(xì)菌病原體污染的背景下，噬菌體裂解蛋白（裂解酶）的特定特性使其成為一種有前景的替代選擇。這些蛋白是由大多數(shù)噬菌體編碼的肽聚糖降解酶。其中一些被稱(chēng)為內(nèi)裂解酶，它們?cè)诹呀庵芷诮Y(jié)束時(shí)產(chǎn)生，有助于由于細(xì)菌細(xì)胞壁破壞（內(nèi)源性裂解）而導(dǎo)致新病毒產(chǎn)物的釋放（圖1A）。其他一些蛋白，即病毒體相關(guān)肽聚糖水解酶（VAPGHs），在噬菌體吸附后部分降解細(xì)胞壁，從而促進(jìn)病毒基因組向宿主細(xì)胞的注入。更具體地說(shuō)，裂解酶靶向存在于肽聚糖中的不同鍵，肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分。當(dāng)這些酶被純化并暴露于這種結(jié)構(gòu)中時(shí)，特別是在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中，它們可以導(dǎo)致“外源性裂解”（圖1B）。即使裂解酶作為重組蛋白被外源性地應(yīng)用，它們也能顯示快速的殺菌活性，能夠消除特定病原體而不會(huì)影響有益微生物群。裂解酶有限的宿主范圍在食品環(huán)境中是方便的，因?yàn)槊糠N特定產(chǎn)品都有自己的微生物生態(tài)系統(tǒng)。在針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的噬菌體裂解酶的情況下，由于其模塊結(jié)構(gòu)，工程化操作可以輕松進(jìn)行，因?yàn)檫@些裂解酶由兩種類(lèi)型的功能域組成：一種非催化功能域，即所謂的細(xì)胞壁結(jié)合域（CBD），參與底物識(shí)別；一種或多種催化功能域，稱(chēng)為酶活性功能域（EAD）（圖2A）。根據(jù)它們?cè)诩?xì)菌肽聚糖中切割的鍵類(lèi)型，EADs可分為不同的類(lèi)別：葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶、裂解型跨糖基酶、裂解酶或糜蛋白酶、酰胺酶和內(nèi)肽酶（圖2B）。最后一種內(nèi)肽酶還可細(xì)分為肽間橋內(nèi)肽酶和L-丙氨酸?；?D-谷氨酸內(nèi)肽酶。這種結(jié)構(gòu)組織使得域交換或刪除成為可能，從而產(chǎn)生具有不同特異性和殺菌活性的新型裂解酶。事實(shí)上，已有研究表明，一些工程化的裂解酶顯示出了比其母體蛋白更高的裂解潛力。

圖1 內(nèi)源性及外源性裂解酶的作用機(jī)制

圖2 （A）革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌內(nèi)裂解酶結(jié)構(gòu)的示意圖；（B）不同肽聚糖鍵的圖表

針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的裂解酶結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性微生物的裂解酶結(jié)構(gòu)不同，因?yàn)樗鼈兺ǔＪ乔蛐蔚鞍踪|(zhì)，具有一個(gè)作為EAD的單一域。為了克服革蘭氏陰性細(xì)菌存在的胞外膜屏障，已經(jīng)通過(guò)添加陽(yáng)離子肽、噬菌體受體結(jié)合蛋白或類(lèi)似裂解酶的細(xì)菌毒素來(lái)設(shè)計(jì)裂解酶。另一種方法是使用膜通透劑，然后在應(yīng)用內(nèi)裂解酶之前使用。令人驚訝的是，一些天然的溶內(nèi)酶能夠在體外作用于革蘭氏陰性細(xì)菌，而無(wú)需使用通透劑。在某些情況下，這種能力與蛋白質(zhì)中存在具有整體正電荷的片段有關(guān)，這些片段可以起到膜通透劑的作用。革蘭氏陰性細(xì)菌溶菌蛋白的另一個(gè)特征是它們具有更廣泛的活性范圍，能夠?qū)Σ煌锓N有效，這可能是因?yàn)樗鼈內(nèi)狈BD。

PhaLP是一個(gè)開(kāi)放的門(mén)戶，提供經(jīng)過(guò)精心篩選的噬菌體裂解蛋白系列，用于指導(dǎo)新型內(nèi)裂解酶基產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。這種數(shù)據(jù)庫(kù)可以加速篩選和驗(yàn)證過(guò)程，有助于識(shí)別潛在的裂解酶，以便進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估，從而在產(chǎn)品研發(fā)初期階段節(jié)省時(shí)間和資源。在針對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生的抗菌解決方案這一快速演變領(lǐng)域的背景下，從多維角度評(píng)估各種可用選項(xiàng)至關(guān)重要。為了協(xié)助這一評(píng)估，我們呈現(xiàn)了噬菌體裂解蛋白與傳統(tǒng)抗菌方法之間的比較分析，每種方法都有其獨(dú)特的特性（圖3）?；谄溆腥さ奶匦?，裂解酶已被測(cè)試作為食品抗菌劑，大量文章支持其在食品安全方面的潛力。本綜述總結(jié)了裂解酶作為食品安全劑的現(xiàn)狀及其在生物控制、生物消毒、生物保藏和生物檢測(cè)方法中的潛在應(yīng)用。

圖3 噬菌體裂解蛋白與傳統(tǒng)抗菌方法的比較分析

02

初級(jí)生產(chǎn)中的生物控制

在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，收獲前和收獲后向作物施用裂解酶可以防止對(duì)植物健康有害的細(xì)菌定植。使用生物殺滅劑或抗生素等傳統(tǒng)化學(xué)制品可能會(huì)影響土壤微生物群落，對(duì)人類(lèi)健康造成危害，同時(shí)還會(huì)促進(jìn)細(xì)菌群體中耐藥性菌株的篩選和傳播，因此有必要尋找替代方法。噬菌體基生物控制已在一些研究中應(yīng)用整個(gè)病毒顆粒，但裂解蛋白的應(yīng)用相對(duì)較新。盡管關(guān)于裂解酶在植物中的應(yīng)用研究仍處于起步階段，但已有一些實(shí)例表明這些酶被成功用于控制植物病原細(xì)菌。另一種方法是生產(chǎn)表達(dá)內(nèi)裂解酶的轉(zhuǎn)基因植物，這些內(nèi)裂解酶可以防止植物病原菌的感染。

由于裂解酶是自然環(huán)境中存在的天然物質(zhì)，它們可以被作為生物農(nóng)藥或生物植物衛(wèi)生產(chǎn)品來(lái)營(yíng)銷(xiāo)，這使得它們適用于有機(jī)農(nóng)業(yè)。與傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥不同，生物農(nóng)藥來(lái)源于自然材料，如微生物或其他生物來(lái)源?？紤]到農(nóng)藥注冊(cè)的成功取決于其對(duì)環(huán)境的潛在影響，且該法規(guī)適用于生物農(nóng)藥，裂解蛋白在美國(guó)是合適的生物農(nóng)藥候選物。數(shù)據(jù)要求列于《聯(lián)邦法規(guī)匯編》（CFR）第40卷第158部分，該部分區(qū)分了生化農(nóng)藥和化學(xué)農(nóng)藥。因此，裂解蛋白可以作為生化農(nóng)藥注冊(cè)，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為是天然存在的物質(zhì)，通過(guò)非毒性機(jī)制控制害蟲(chóng)。

在畜牧業(yè)中，抗生素被廣泛應(yīng)用，不僅用于預(yù)防或治療感染，還用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。這種過(guò)度使用已導(dǎo)致抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)。因此，需要替代產(chǎn)品，噬菌體衍生的產(chǎn)品已被認(rèn)為是歐洲最新獸醫(yī)藥物監(jiān)管框架中一個(gè)可行的選擇。事實(shí)上，不同的研究已經(jīng)報(bào)道了裂解酶在體外和體內(nèi)的有效性，這些裂解酶能夠?qū)共煌募倚蟛≡w。盡管“內(nèi)裂解酶”或“裂解酶”這一名稱(chēng)源于它們?cè)谑删w生命周期中的作用，但它們也可以被歸類(lèi)為“酶制劑”，這是一個(gè)更寬泛的術(shù)語(yǔ)，由“酶”和“抗生素”兩個(gè)詞組合而成，涵蓋了所有具有抗菌活性的酶。例如，有大量證據(jù)表明酶制劑具有治療乳腺炎的潛力，乳腺炎是家畜中最常見(jiàn)的傳染病之一。乳腺炎是乳腺的炎癥，可由多種微生物引起。它是畜牧業(yè)中最昂貴的疾病，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)奶量下降和過(guò)早淘汰動(dòng)物。導(dǎo)致乳腺炎的主要病原體是各種鏈球菌屬、金黃色葡萄球菌和埃希氏大腸桿菌，這些微生物已被證明對(duì)裂解酶敏感。

03

生物消毒

眾所周知，消毒對(duì)于保持農(nóng)業(yè)食品行業(yè)無(wú)不需要的微生物至關(guān)重要，這些微生物可能傳播給工人或消費(fèi)者。由于生物膜的結(jié)構(gòu)，嵌入胞外基質(zhì)中的細(xì)菌細(xì)胞很難被消毒劑觸及，這使得它們成為一個(gè)潛在的儲(chǔ)存庫(kù)，細(xì)菌可能由此接觸到食品處理人員甚至食品產(chǎn)品。因此，完全清除生物膜并非易事，尤其是因?yàn)樗鼈兺ǔ：休^高比例的持久性細(xì)胞，這些細(xì)胞能夠耐受多種消毒劑的處置，隨后允許生物膜重新生長(zhǎng)。由于裂解酶負(fù)責(zé)分解肽聚糖，破壞生物膜細(xì)胞的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)成分，因此它們可以被用作生物消毒劑，以防止生物膜的定植和形成。此外，評(píng)估裂解酶作為消毒劑在烹飪器具和餐具中常用材料中的潛在應(yīng)用也很重要。

裂解酶在收獲前消毒過(guò)程中可以發(fā)揮關(guān)鍵作用，確保食品供應(yīng)的安全性并最大程度地降低食源性疾病感染的風(fēng)險(xiǎn)。裂解酶具有消滅正在分裂的細(xì)胞和非分裂的細(xì)胞的能力，且不受細(xì)菌代謝狀態(tài)的影響。此外，與抗生素相比，它們顯示出更強(qiáng)的穿透生物膜更深層的能力。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)可以通過(guò)防止細(xì)菌表面附著和破壞或破壞完全形成的生物膜來(lái)促進(jìn)。在某些情況下，裂解酶甚至能夠在亞抑制濃度下阻止生物膜的形成，這一效果可能與它們能夠抑制某些細(xì)菌（如金黃色葡萄球菌）中自溶菌編碼基因的表達(dá)有關(guān)。一個(gè)具有里程碑意義的例子是由LysCSA13提供的，這是一種葡萄球菌內(nèi)裂解酶，在不同材料上實(shí)現(xiàn)了80%至90%的生物量減少，這些材料包括不銹鋼、玻璃和聚苯乙烯。已有報(bào)道顯示，幾種葡萄球菌裂解蛋白具有抗生物膜活性，例如LysH5、CHAP-SH3b、LysRODI和LysRODI?Ami等。值得注意的是，LysH5也被發(fā)現(xiàn)能有效對(duì)抗持久性細(xì)胞。除了葡萄球菌生物膜外，重組裂解酶已被證明可有效對(duì)抗由各種食品病原體和腐敗微生物（包括革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌）形成的生物膜。例如，內(nèi)裂解酶293-酰胺酶顯示出抗李斯特菌活性，能夠阻止單核細(xì)胞增多李斯特菌在無(wú)機(jī)表面形成生物膜。

生物膜對(duì)抗菌劑的敏感性很大程度上取決于生物膜的復(fù)雜性、菌株敏感性以及生物膜成熟階段等因素。由于這些復(fù)雜性，完全消除整個(gè)生物膜生物量（包括附著細(xì)胞和胞外物質(zhì)）可能具有挑戰(zhàn)性。因此，一種結(jié)合噬菌體、裂解酶、抗生素和其他抗菌劑的綜合方法已被證明是實(shí)現(xiàn)生物膜清除的有效手段。使用噬菌體和酶處理與其他抗菌劑聯(lián)合使用，已在對(duì)抗生物膜方面顯示出有希望的結(jié)果。商用噬菌體基消毒劑已上市銷(xiāo)售，這證實(shí)了它們?cè)谙嚓P(guān)領(lǐng)域的巨大潛力，這些消毒劑使用完整的病毒顆粒。然而，裂解酶基消毒劑尚未作為商用產(chǎn)品上市，這主要是由于在確保其穩(wěn)定性和長(zhǎng)期有效性方面存在重大挑戰(zhàn)，同時(shí)還需要建立高效且成本效益的制造方法，以促進(jìn)其更廣泛的應(yīng)用。在此背景下，研究應(yīng)聚焦于優(yōu)化配方，以提高裂解酶基消毒劑的穩(wěn)定性和貨架期。從這個(gè)意義上講，包埋技術(shù)或使用穩(wěn)定劑以及新型遞送方法等技術(shù)均可有助于提高性能。這可能是因?yàn)槿狈?quán)威的指導(dǎo)方針，無(wú)法滿足作為生物殺滅活性物質(zhì)批準(zhǔn)所要求的特定標(biāo)準(zhǔn)。

04

生物保存

生物保存是指通過(guò)使用天然劑來(lái)抑制食源性病原體和腐敗微生物群落，從而延長(zhǎng)食品保質(zhì)期，由此提高安全性并防止腐敗。裂解酶作為生物防腐劑的主要優(yōu)勢(shì)之一是其高特異性。實(shí)際上，它們可以被用于靶向食用產(chǎn)品中的特定細(xì)菌，而不會(huì)影響食品和消費(fèi)者的微生物生態(tài)系統(tǒng)。同時(shí)，溶菌蛋白的適用范圍比噬菌體更廣，這增加了它們的適用性。盡管已有報(bào)道顯示裂解酶在各種食品中有效，但其在乳制品中的應(yīng)用研究可能最為深入。在乳制品中，產(chǎn)生腸毒素（如金黃色葡萄球菌）的食源性病原體是最具針對(duì)性的微生物，因?yàn)槟承┠c毒素具有耐熱性，即使在經(jīng)過(guò)熱處理殺死細(xì)菌后，這些毒素仍能在食品中殘留。因此，必須在這些微生物產(chǎn)生并釋放內(nèi)毒素進(jìn)入食品基質(zhì)之前盡早對(duì)其進(jìn)行控制。此外，這些內(nèi)毒素可能存在于由生奶制成的奶酪以及其他手工制作的乳制品中。在這種情況下，裂解酶可以成為一種良好的策略，既能防止產(chǎn)生內(nèi)毒素的細(xì)菌增殖，同時(shí)又不影響發(fā)酵微生物的生長(zhǎng)。

一些病原體能夠抵抗食品加工方法，這個(gè)問(wèn)題可以通過(guò)使用活性食品包裝來(lái)解決，這種包裝系統(tǒng)通過(guò)與食品表面相互作用來(lái)釋放生物活性化合物。在這種情況下，例如，噬菌體裂解蛋白可以被添加到材料的基質(zhì)中，以作為一種抗菌包裝系統(tǒng)來(lái)改善食品安全。同樣，這種方法僅通過(guò)與細(xì)菌噬菌體結(jié)合，將其整合到生物聚合物中，以創(chuàng)建抗菌薄膜，但裂解酶也是一個(gè)有前景的選擇。此外，裂解蛋白沒(méi)有噬菌體的一些潛在缺點(diǎn)，特別是在抗藥性發(fā)展方面。

盡管已在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模成功展示了裂解酶的使用，但其潛在應(yīng)用可能因食品條件而異。例如，這些酶的效率取決于食品基質(zhì)以及其他參數(shù)，包括溫度、pH值、鹽濃度或儲(chǔ)存時(shí)間。需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究來(lái)評(píng)估這些參數(shù)，并描述特定食品中的溶菌活性。迄今為止，已有幾份報(bào)告探討了裂解酶類(lèi)生物保鮮技術(shù)在不同食品產(chǎn)品中的應(yīng)用，其中乳制品是最廣泛研究的領(lǐng)域（表1）。事實(shí)上，許多內(nèi)裂解酶已成功在牛奶中對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行了測(cè)試。例如，LysH5在6小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了8-lg的減少，而CHAP-SH3b在不同類(lèi)型的牛奶中可以在15 min內(nèi)消除金黃色葡萄球菌。在最近的一項(xiàng)研究中，內(nèi)溶菌LysRODI及其衍生變體LysRODI?Ami在牛奶中和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的鮮奶酪生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出良好的效果。

表1內(nèi)裂解酶在幾種食品基質(zhì)中對(duì)抗不同食源性病原體的應(yīng)用概述

裂解酶也可以通過(guò)將其與其他抗菌劑或高壓處理等物理處理相結(jié)合，用作障礙技術(shù)方法的一部分。由于高壓處理會(huì)影響到食品的質(zhì)地、顏色或風(fēng)味等多種品質(zhì)因素，因此使用裂解蛋白可以在保持最佳抗菌效果的同時(shí)降低處理壓力水平。將內(nèi)裂解酶PlyP825和高壓處理應(yīng)用于不同食品產(chǎn)品（如牛奶和馬蘇里拉奶酪）時(shí)，還發(fā)現(xiàn)在4 ℃儲(chǔ)存的新鮮奶酪中，內(nèi)裂解酶PlyP100與細(xì)菌素乳酸鏈球菌素之間存在長(zhǎng)期的協(xié)同作用，能夠?qū)箚魏思?xì)胞增多李斯特菌。

05

生物檢測(cè)

針對(duì)食源性病原體的經(jīng)典檢測(cè)方法是基于在瓊脂選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物，這些方法既耗時(shí)又勞動(dòng)密集。為了克服這一問(wèn)題，已采用PCR或ELISA等生化技術(shù)來(lái)檢測(cè)特定的食源性病原體或編碼毒素基因，但這些方法成本高昂且/或操作繁瑣。在此背景下，必須強(qiáng)調(diào)的是，裂解酶已進(jìn)化為能夠與細(xì)菌細(xì)胞壁表面上的分子特異性相互作用，是特定病原體的天然生物傳感器。這種識(shí)別依賴(lài)于裂解酶的CBD，該CBD能夠以高度特異性和親和力結(jié)合肽聚糖（類(lèi)似于抗體-抗原相互作用）。這種特異性已被用于檢測(cè)不同環(huán)境中的微生物。因此，CBD為設(shè)計(jì)高度靈敏和快速的病原體檢測(cè)系統(tǒng)提供了機(jī)會(huì)，這些系統(tǒng)不僅適用于食品基質(zhì)，還適用于非生物表面，從而能夠早期檢測(cè)危險(xiǎn)的微生物，否則這些微生物可能會(huì)到達(dá)消費(fèi)者手中。

此外，已利用一種磁分離技術(shù)，通過(guò)CBD來(lái)量化病原體的濃度。使用這些CBD涂覆的微粒通過(guò)免疫磁分離法檢測(cè)牛奶中多達(dá)400 CFU的金黃色葡萄球菌。在另一項(xiàng)研究中，CBD包被的微珠與qPCR的組合在PBS中實(shí)現(xiàn)了2 CFU/mL的卓越檢測(cè)水平，在牛奶或牛肉提取物中則低于10 CFU/mL。盡管使用CBDs進(jìn)行病原體檢測(cè)有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如高特異性、快速檢測(cè)和交叉反應(yīng)概率低，但一個(gè)主要缺點(diǎn)是這種方法由于存在外膜而無(wú)法有效檢測(cè)革蘭氏陰性病原體。

06

噬菌體裂解蛋白在工業(yè)應(yīng)用中的潛在障礙

噬菌體裂解蛋白顯示出在食品生產(chǎn)鏈中應(yīng)用的巨大潛力，特別是在控制對(duì)傳統(tǒng)抗菌策略具有抗藥性的細(xì)菌病原體方面。然而，它們?cè)谑称饭I(yè)中的應(yīng)用面臨著一些挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)必須為未來(lái)的研究所考慮，如穩(wěn)定性與貨架期、安全性以及成本效益。

就穩(wěn)定性和貨架期而言，這些酶的長(zhǎng)期效果可能受到多種環(huán)境因素的影響，如溫度和pH值。雖然不同酶的裂解酶的最佳儲(chǔ)存溫度可能有所不同，但通常建議在冷藏溫度（2～4 ℃）下儲(chǔ)存，以保持其活性不受時(shí)間影響。裂解蛋白也可在-20 ℃甚至-80 ℃下儲(chǔ)存，但需加入穩(wěn)定劑如甘油，但冷凍-解凍循環(huán)可能會(huì)對(duì)穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響。一般來(lái)說(shuō)，噬菌體裂解蛋白在適中的溫度范圍內(nèi)（通常為20～45 ℃）是活躍且穩(wěn)定的。這可能是因?yàn)榇蠖鄶?shù)已研究的噬菌體是中溫性的，而它們的嗜熱性對(duì)應(yīng)物尚未得到充分研究。在某些情況下，裂解蛋白在暴露于高溫后仍能保持活性，這可能對(duì)其在食品加工等各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用有益。自然界中存在多種耐溫內(nèi)溶菌的例子，如之前提到的TP84_28、Lys68、PVP-SE1gp36和Ph2119，其中一些已被報(bào)道能夠耐受高達(dá)95 ℃的溫度。未來(lái)的研究應(yīng)聚焦于評(píng)估和改善溶菌蛋白的熱穩(wěn)定性，這對(duì)于評(píng)估其長(zhǎng)期儲(chǔ)存和應(yīng)用是必要的。此外，在旨在提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性時(shí)，通常需要結(jié)合多個(gè)對(duì)穩(wěn)定性有單獨(dú)、較小影響的氨基酸突變。如果每個(gè)突變都采用不同的穩(wěn)定化機(jī)制，這些有益突變的結(jié)合可以協(xié)同穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

與溫度類(lèi)似，pH值的改變也會(huì)導(dǎo)致溶菌活性的喪失。一般來(lái)說(shuō)，許多裂解酶在略微酸性或中性的pH值下表現(xiàn)出最佳活性，通常介于pH 6～7.5之間。同樣，自然界中存在一些噬菌體裂解酶，它們能夠耐受更廣泛的pH范圍，例如LysZC1內(nèi)裂解酶，其活性范圍在pH 5～10之間。值得注意的是，LysRODI在pH 7時(shí)顯示出最高的活性，但也在pH 5～9的范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性。這種適應(yīng)性是一個(gè)值得注意的特征，它反映了裂解酶行為中的多樣性。因此，優(yōu)化潛在制劑的pH值有助于維持裂解酶的穩(wěn)定性。另一個(gè)合適的策略可能是對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行工程改造，以擴(kuò)大其pH值范圍。

另一種方法是將裂解酶包裹在納米顆粒、脂質(zhì)體或其他遞送系統(tǒng)中，以保護(hù)它們免受環(huán)境因素的影響并延長(zhǎng)其保質(zhì)期。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)溶菌蛋白的控釋?zhuān)⒂兄跍p少它們暴露于光、氧氣或其他化合物中的程度。已進(jìn)行了多種噬菌體和裂解酶的包裹研究，但迄今為止獲得的包裹效率相當(dāng)?shù)?，最高大約為35%。盡管這些例子大多集中在噬菌體上，但也有一些關(guān)于內(nèi)裂解酶包被的例子。將內(nèi)裂解酶LysRODI包封在脂質(zhì)體中，這些脂質(zhì)體是由雙層脂質(zhì)構(gòu)成的球形結(jié)構(gòu)，能夠有效地將藥物遞送至細(xì)胞。

溶菌蛋白的安全性可能受到多種因素的影響，包括特定的酶、劑量、給藥途徑以及與其他化合物的潛在相互作用。因此，在使用這些酶于食品工業(yè)之前，必須考慮其安全性。例如，溶菌蛋白的抗菌特性和特異性降低了產(chǎn)生非目標(biāo)效應(yīng)和不良副作用的潛在可能性。此外，這些酶可能迅速被人體中的蛋白酶降解，這將限制其持久性以及累積或長(zhǎng)期影響的可能性。事實(shí)上，多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究已報(bào)道，當(dāng)以局部和全身兩種方式給藥時(shí)，裂解酶對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)是安全的。2014年的一項(xiàng)研究考察了內(nèi)裂解酶SAL-1在兩種動(dòng)物模型（犬和嚙齒類(lèi)動(dòng)物）中的安全性，方法是靜脈注射一種基于噬菌體內(nèi)裂解酶的藥物SAL200（含有SAL-1）。經(jīng)過(guò)數(shù)周的給藥管理，未發(fā)現(xiàn)任何毒性跡象。2018年，一項(xiàng)關(guān)于兩種內(nèi)裂解酶（PaI和CpI-1）對(duì)肺炎鏈球菌的毒性和臨床前安全性的研究顯示，在細(xì)胞系中未觀察到顯著的炎癥基因表達(dá)、微生物群落變化或細(xì)胞反應(yīng)。同樣在這項(xiàng)研究中，作者在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了一項(xiàng)體內(nèi)毒性研究，并觀察到免疫球蛋白G（IgG）水平增加，而對(duì)裂解活性沒(méi)有影響。值得注意的是，無(wú)論是Cp1-1還是Pa1均未引發(fā)IgE反應(yīng)，而IgE反應(yīng)通常與過(guò)敏反應(yīng)和超敏反應(yīng)相關(guān)。將該物質(zhì)局部應(yīng)用于患有特應(yīng)性皮炎的患者時(shí)，觀察到報(bào)告了一種重組嵌合內(nèi)裂解酶的功效（EndobiomaTM），該內(nèi)裂解酶可有效對(duì)抗金黃色葡萄球菌。綜上所述，關(guān)于裂解酶安全性的大量研究結(jié)果支持其在臨床領(lǐng)域以及食品安全和食品加工系統(tǒng)中的使用。

總的來(lái)說(shuō)，行業(yè)中裂解蛋白的成本效益是一個(gè)重要的考慮因素，這取決于幾個(gè)因素，包括生產(chǎn)成本、功效以及最終的監(jiān)管批準(zhǔn)。最后一個(gè)因素可能非常具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)槊總€(gè)國(guó)家都有自己的監(jiān)管機(jī)構(gòu)，每個(gè)商業(yè)應(yīng)用都有自己的政策和法規(guī)。在表2中，簡(jiǎn)要的比較概述了美國(guó)和歐洲的監(jiān)管機(jī)構(gòu)及其賴(lài)氨酸監(jiān)管方法。雖然這兩個(gè)區(qū)域確實(shí)在全球監(jiān)管格局中占有重要地位，但必須認(rèn)識(shí)到，整體視角也應(yīng)包括其他國(guó)家的監(jiān)管框架。美國(guó)和歐洲是了解監(jiān)管環(huán)境的寶貴基準(zhǔn)，是尋求將內(nèi)裂解酶解決方案引入國(guó)際市場(chǎng)的公司理想的起點(diǎn)。印度和中國(guó)等人口稠密的國(guó)家面臨一系列獨(dú)特的挑戰(zhàn)，需要全面審查新型抗菌藥物的監(jiān)管考慮。這些考慮對(duì)于解決與食品安全、公共衛(wèi)生和可持續(xù)農(nóng)業(yè)實(shí)踐相關(guān)的關(guān)鍵問(wèn)題至關(guān)重要。在印度，負(fù)責(zé)這一職責(zé)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)是印度食品安全和標(biāo)準(zhǔn)局（FSSAI）。在中國(guó)，中國(guó)食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心（CFSA）也扮演著類(lèi)似的角色，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局（SAMR）在監(jiān)管動(dòng)物藥品和殺生劑等不同種類(lèi)的產(chǎn)品方面發(fā)揮著核心作用。

表2監(jiān)管機(jī)構(gòu)的概述及其在美國(guó)和歐洲監(jiān)管潛在商業(yè)內(nèi)裂解酶應(yīng)用的方法

食品安全法規(guī)可能會(huì)影響這些新型抗菌劑的生產(chǎn)成本，但其審批過(guò)程也可能費(fèi)用高昂且耗時(shí)較長(zhǎng)。實(shí)際上，相關(guān)申請(qǐng)可能需要多年審查，就食品添加劑而言，平均成本可能高達(dá)數(shù)千美元。例如，在美國(guó)獲得GRAS批準(zhǔn)的估計(jì)總成本包括毒理學(xué)研究和安全性評(píng)估、專(zhuān)家咨詢和科學(xué)數(shù)據(jù)匯編、GRAS通知準(zhǔn)備、監(jiān)管咨詢和法律費(fèi)用，以及由FDA承擔(dān)的相應(yīng)行政費(fèi)用。應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)需要采取多學(xué)科方法，包括行業(yè)、監(jiān)管機(jī)構(gòu)和研究人員之間的合作，以確保在食品行業(yè)中安全有效地使用裂解酶。

07

Conclusion

總體而言，為了保障環(huán)境和人類(lèi)福祉，控制抗菌藥物使用的監(jiān)管規(guī)定是必不可少的。然而，將天然抗菌產(chǎn)品投放市場(chǎng)涉及監(jiān)管負(fù)擔(dān)，這可能延緩新型化合物的開(kāi)發(fā)。就噬菌體裂解蛋白而言，考慮到迫切需要克服當(dāng)前的抗菌藥物耐藥性威脅并解決全球食品安全問(wèn)題，這是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。事實(shí)上，在實(shí)驗(yàn)室鑒定的所有有前景的裂解酶中，目前只有一種已經(jīng)商業(yè)化（StaphefektTM，作為醫(yī)療器械，依據(jù)指令93/42/EEC，用于皮膚護(hù)理應(yīng)用）。此外，必須認(rèn)識(shí)到，關(guān)于使用抗微生物劑（包括裂解酶）的監(jiān)管和法律框架遠(yuǎn)非統(tǒng)一。不同國(guó)家和協(xié)會(huì)有不同的監(jiān)管框架、審批流程和標(biāo)準(zhǔn)。這些差異可能對(duì)裂解酶在食品安全領(lǐng)域的全球采用構(gòu)成挑戰(zhàn)。應(yīng)對(duì)多樣化的監(jiān)管環(huán)境，并確保符合區(qū)域要求，是更廣泛地利用基于裂解酶的抗微生物劑時(shí)需要考慮的關(guān)鍵問(wèn)題。隨著我們?cè)诿钢苿┖土呀饷笐?yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)步，在全球范圍內(nèi)協(xié)調(diào)監(jiān)管方法，以促進(jìn)這些新型抗微生物解決方案的開(kāi)發(fā)、審批和商業(yè)可用性，同時(shí)維護(hù)最高的安全和有效性標(biāo)準(zhǔn)，變得越來(lái)越重要。盡管如此，在食品行業(yè)中實(shí)施酶制劑所面臨的挑戰(zhàn)并不僅限于監(jiān)管方面。例如，這些蛋白質(zhì)必須在它們將被應(yīng)用的動(dòng)物/表面/食品上實(shí)現(xiàn)最佳穩(wěn)定性，同時(shí)必須以適中的成本保證裂解酶的生產(chǎn)，以便在工業(yè)水平上實(shí)現(xiàn)其生產(chǎn)的可行規(guī)?；??？傮w而言，關(guān)于溶蝕蛋白的有效性和安全性的大量研究，為將這些酶作為抗菌劑用于改善食品安全開(kāi)辟了新的途徑。在這種情況下，只要裂解酶滿足相應(yīng)的要求，主管當(dāng)局應(yīng)考慮到現(xiàn)有的科學(xué)證據(jù)，為這些新產(chǎn)品的批準(zhǔn)提供便利。

Phage lytic proteins: a natural approach to agro-food safety

Seila Agúna,b, Lucía Fernándeza,b,*, Ana Rodrígueza,b, Pilar Garcíaa,b

a Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA-CSIC), Asturias 33300, Spain

b Dairy Safe Group, Instituto de Investigación Sanitaria del Principado de Asturias (ISPA), Oviedo 33011, Spain

*Corresponding author.

Abstract

Sustainability is a leading trend in the context of food production. Additionally, consumers increasingly demand safer and less-processed products. Among the different technologies used to maintain the quality and extend the shelf-life of fresh and minimally-processed food, natural antimicrobial agents offer a promising strategy to replace conventional compounds. In this regard, phage lytic proteins or lysins, such as endolysins and virion-associated peptidoglycan hydrolases (VAPGHs), have been proposed as a viable option for the avoidance and elimination of undesirable bacteria within the food production chain. Even when applied exogenously, these proteins can degrade the bacterial cell wall maintaining their lytic activity. This feature, alongside their modular structure, which can be exploited for bioengineering, provides significant biotechnological potential. However, despite the promising properties of lysins, the main obstacle for their commercialization is the limited legal information regulating their use. This challenge underscores the need to navigate complex regulatory pathways. The primary objective of this review is to address this crucial gap and summarize the many prospective applications of endolysins during the different stages of food production. By doing so, we aim to provide clarity and insight into the regulatory challenges that must be overcome for the successful utilization of lysins.

Reference:

AGúN S, FERNáNDEZ L, RODRíGUEZ A, et al. Phage lytic proteins: a natural approach to agro-food safety[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(6): 9250128. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250128.

翻譯：羅敬（實(shí)習(xí)）

編輯：梁安琪；責(zé)任編輯：孫勇

封面圖片：攝圖網(wǎng)

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