導(dǎo)語(yǔ)

理解和預(yù)測(cè)單細(xì)胞在化學(xué)、遺傳或機(jī)械擾動(dòng)下的分子響應(yīng)是生物學(xué)中的核心問(wèn)題。獲取單細(xì)胞測(cè)量數(shù)據(jù)通常需要破壞細(xì)胞，這使得學(xué)習(xí)異質(zhì)性擾動(dòng)響應(yīng)具有挑戰(zhàn)性。因?yàn)檠芯空邆儍H能觀察到擾動(dòng)或未擾動(dòng)細(xì)胞的未配對(duì)分布。在此，他們利用最優(yōu)傳輸理論和近期出現(xiàn)的輸入凸神經(jīng)架構(gòu)，提出了CellOT框架：該框架通過(guò)映射這些未配對(duì)分布，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞在特定擾動(dòng)下響應(yīng)的學(xué)習(xí)。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)渭?xì)胞擾動(dòng)響應(yīng)，神經(jīng)最優(yōu)傳輸，輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，異質(zhì)性，泛化能力，單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），多重蛋白質(zhì)成像

王璇丨作者

鄭鴻盛、趙思怡丨審校

論文題目：Learning single-cell perturbation responses using neural optimal transport 論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-023-01969-x 發(fā)表時(shí)間：2023 年 9 月 28 日 論文來(lái)源：Nature Methods

目錄

理論基礎(chǔ)與關(guān)鍵方法

CellOT模型與單細(xì)胞擾動(dòng)預(yù)測(cè)

通過(guò)最優(yōu)傳輸映射預(yù)測(cè)擾動(dòng)反應(yīng)

CellOT性能優(yōu)于現(xiàn)有最先進(jìn)方法

CellOT捕捉藥物反應(yīng)中的細(xì)胞間變異性

CellOT分離亞群特異性藥物效應(yīng)

CellOT精準(zhǔn)推斷未見(jiàn)過(guò)患者的細(xì)胞反應(yīng)

CellOT 可跨物種重建固有免疫反應(yīng)

CellOT將分化結(jié)果擴(kuò)展至低潛能細(xì)胞

從非時(shí)間分辨數(shù)據(jù)中表征單細(xì)胞擾動(dòng)反應(yīng)是生物學(xué)的一大挑戰(zhàn)，但對(duì)預(yù)測(cè)細(xì)胞對(duì)環(huán)境壓力或藥物的反應(yīng)至關(guān)重要，尤其有助于理解腫瘤細(xì)胞逃避治療的機(jī)制。單細(xì)胞擾動(dòng)反應(yīng)高度異質(zhì)，受基因/蛋白豐度、細(xì)胞狀態(tài)和微環(huán)境等因素影響，因此分析中必須納入多變量亞群結(jié)構(gòu)，以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)個(gè)體細(xì)胞的藥物反應(yīng)。

學(xué)習(xí)擾動(dòng)反應(yīng)的核心難題在于：細(xì)胞測(cè)量通常需要破壞性處理，無(wú)法獲取配對(duì)對(duì)照/擾動(dòng)單細(xì)胞數(shù)據(jù)，只能獲得獨(dú)立的觀測(cè)集。匹配不同條件下的單細(xì)胞，同時(shí)考慮異質(zhì)性，是復(fù)雜的配對(duì)問(wèn)題。

本文提出CellOT，一種基于神經(jīng)最優(yōu)傳輸?shù)臄_動(dòng)模型，通過(guò)學(xué)習(xí)對(duì)照與擾動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)的映射，直接預(yù)測(cè)單細(xì)胞擾動(dòng)反應(yīng)，同時(shí)顯式考慮多重分子讀數(shù)中的亞群異質(zhì)性。CellOT假設(shè)擾動(dòng)逐步改變細(xì)胞特征（如基因表達(dá)或信號(hào)活性），利用最優(yōu)傳輸理論（OT）建模這些變化，并通過(guò)輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)化對(duì)偶勢(shì)，實(shí)現(xiàn)高度可擴(kuò)展且穩(wěn)健的映射學(xué)習(xí)，可推廣至未見(jiàn)過(guò)的樣本或患者。

CellOT在四個(gè)方面驗(yàn)證了有效性：（1）學(xué)習(xí)黑色素瘤細(xì)胞系中不同抗癌藥物的單細(xì)胞標(biāo)志物反應(yīng)；（2）預(yù)測(cè)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者活檢樣本中的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組反應(yīng)，以及膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的帕比司他治療結(jié)果；（3）推斷不同動(dòng)物物種對(duì)脂多糖（LPS）的反應(yīng)；（4）建模造血過(guò)程中細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄組演變。此外，在多個(gè)任務(wù)上[12, 13]將CellOT與當(dāng)前最先進(jìn)的方法進(jìn)行了基準(zhǔn)測(cè)試。

理論基礎(chǔ)與關(guān)鍵方法

近年來(lái)，高通量技術(shù)能夠在單細(xì)胞層面揭示細(xì)胞群體對(duì)各種擾動(dòng)的響應(yīng)規(guī)律，但這些數(shù)據(jù)通常不具備時(shí)間分辨性，且擾動(dòng)前后的數(shù)據(jù)未經(jīng)過(guò)對(duì)齊處理。因此，理解單細(xì)胞如何響應(yīng)擾動(dòng)，需要依賴數(shù)學(xué)建模方法來(lái)刻畫(huà)對(duì)照組與擾動(dòng)組之間的映射關(guān)系。在這里，最優(yōu)傳輸（Optimal Transport, OT）提供了一個(gè)自然的框架。

最優(yōu)傳輸具有雙重作用。它既可以在分布之間引入一種數(shù)學(xué)性質(zhì)良好的距離度量，又能提供一種基于幾何的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)概率分布之間的耦合。設(shè)μ和ν為空間中的兩個(gè)測(cè)度。蒙日提出的最優(yōu)傳輸問(wèn)題定義為：

其中，對(duì)應(yīng)最小代價(jià)的映射T即為最優(yōu)傳輸映射。該公式是非凸的，求解難度較大。多年后，康托羅維奇[54]提出了一種松弛方法，允許進(jìn)行軟分配，其形式為：

式中多面體Γ(μ, ν)的定義為，它描述了μ和ν之間所有耦合（或聯(lián)合分布）的集合。因此，最優(yōu)傳輸計(jì)劃γ對(duì)應(yīng)于使整體傳輸代價(jià)最小的兩個(gè)概率分布之間的耦合?；谧顑?yōu)傳輸耦合γ，μ和ν之間的距離W(μ, ν)被稱為Wasserstein距離。計(jì)算式(2)中的最優(yōu)傳輸距離需要求解線性規(guī)劃問(wèn)題，由此產(chǎn)生的計(jì)算成本對(duì)于大規(guī)模機(jī)器學(xué)習(xí)任務(wù)而言過(guò)高。通過(guò)引入熵項(xiàng)對(duì)目標(biāo)函數(shù)(2)進(jìn)行正則化，能夠顯著提升優(yōu)化效率[55]，同時(shí)保證目標(biāo)函數(shù)關(guān)于輸入的可微性，因此該方法常被用作機(jī)器學(xué)習(xí)中的損失函數(shù)。

式(2)為最優(yōu)傳輸?shù)脑紗?wèn)題形式?？低辛_維奇同時(shí)提出了對(duì)應(yīng)的對(duì)偶問(wèn)題[54]，該對(duì)偶問(wèn)題是一個(gè)帶約束的凹函數(shù)最大化問(wèn)題，定義如下：

其中容許勢(shì)函數(shù)集合Φc的定義為（定理1.3）。維拉尼的定理2.9[23]進(jìn)一步將關(guān)于函數(shù)對(duì)(g, f)的對(duì)偶問(wèn)題(3)簡(jiǎn)化為：

式中是空間中所有凸函數(shù)的集合，，為f的凸共軛函數(shù)。將測(cè)度μ映射到ν的最優(yōu)傳輸映射對(duì)應(yīng)于f的梯度，即T=?f?？梢酝ㄟ^(guò)構(gòu)造最優(yōu)傳輸計(jì)劃。維拉尼的定理2.9證明了在空間中存在一個(gè)由下半連續(xù)的真共軛凸函數(shù)構(gòu)成的最優(yōu)函數(shù)對(duì)(f, f*)，能夠使式(3)取得最小值。

輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。像式(4)中的這樣的凸空間，可以通過(guò)對(duì)輸入具有凸性的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行參數(shù)化表示。阿莫斯等人[22]提出的輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ICNN）就是一種這類參數(shù)化方法。輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基于全連接前饋網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)參數(shù)施加約束來(lái)保證函數(shù)的凸性。一個(gè)參數(shù)為的輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)表示一個(gè)凸函數(shù)f(x ; θ)，對(duì)于第i層（i=0… L-1），其定義為：

其中激活函數(shù)σi為凸且非遞減函數(shù)，同時(shí)所有權(quán)重矩陣的元素都被約束為非負(fù)數(shù)。盡管存在這些約束，輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)仍能對(duì)一大類凸函數(shù)進(jìn)行參數(shù)化。陳等人[56]從理論上證明，定義在凸域上的任意凸函數(shù)都可以通過(guò)輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在一致范數(shù)意義下進(jìn)行逼近。黃等人[57]進(jìn)一步將輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)從全連接前饋結(jié)構(gòu)擴(kuò)展到卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。此外，輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)還被用于對(duì)Wasserstei梯度流[58-60]和重心[61]進(jìn)行參數(shù)化。

CellOT模型與單細(xì)胞擾動(dòng)預(yù)測(cè)

近年來(lái)發(fā)展的高通量技術(shù)能夠在單細(xì)胞層面揭示細(xì)胞群體對(duì)各種擾動(dòng)的響應(yīng)規(guī)律。但這類數(shù)據(jù)通常不具備時(shí)間分辨性，且數(shù)據(jù)之間未經(jīng)過(guò)對(duì)齊處理。因此，擾動(dòng)前后生物樣本的快照無(wú)法提供單個(gè)細(xì)胞的軌跡信息。擾動(dòng)的形式包括施加影響細(xì)胞分子功能的藥物，或是改變細(xì)胞所處環(huán)境引發(fā)生物信號(hào)通路的變化，這些擾動(dòng)會(huì)通過(guò)多種方式影響細(xì)胞及其狀態(tài)。

下文將介紹研究者的方法，該方法通過(guò)學(xué)習(xí)對(duì)照組與擾動(dòng)組細(xì)胞狀態(tài)之間的映射關(guān)系，來(lái)揭示單細(xì)胞的擾動(dòng)響應(yīng)規(guī)律。設(shè)X為由測(cè)得的細(xì)胞特征所張成的生物數(shù)據(jù)空間，研究者將細(xì)胞對(duì)第k種擾動(dòng)的響應(yīng)視為在高維細(xì)胞狀態(tài)空間中的演化過(guò)程。

基于神經(jīng)最優(yōu)傳輸方法還原擾動(dòng)效應(yīng)。給定一個(gè)包含n個(gè)觀測(cè)樣本的數(shù)據(jù)集，其中樣本服從擾動(dòng)前的細(xì)胞分布。同時(shí)給定另一組獨(dú)立樣本，其中樣本，研究者的目標(biāo)是預(yù)測(cè)細(xì)胞在受到第k種擾動(dòng)后的分布。

細(xì)胞的擾動(dòng)響應(yīng)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程：施加擾動(dòng)k后，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)隨時(shí)間演化，因此可以將其建模為細(xì)胞數(shù)據(jù)空間中的一個(gè)隨機(jī)過(guò)程。盡管單細(xì)胞響應(yīng)具有時(shí)間分辨的特性，但只能獲取擾動(dòng)前的細(xì)胞狀態(tài)分布ρc和施加擾動(dòng)k后的分布ρk。因此，需要在缺乏時(shí)間分辨的擾動(dòng)響應(yīng)數(shù)據(jù)的情況下，通過(guò)揭示ρc和ρk之間的映射T，來(lái)理解其背后的隨機(jī)過(guò)程?；谝延械纳飳W(xué)知識(shí)，可以假設(shè)擾動(dòng)不會(huì)劇烈或完全改變細(xì)胞的基本生物學(xué)過(guò)程。因此，研究者們提出，可以利用最優(yōu)傳輸這一數(shù)學(xué)理論來(lái)建模單細(xì)胞概率分布在擾動(dòng)后的演化規(guī)律。

借鑒馬克瓦等人的研究思路[18]，學(xué)習(xí)ρc和ρk之間的最優(yōu)傳輸映射T（見(jiàn)式(1)）。與希賓格等人[17]使用現(xiàn)有求解器為每一對(duì)細(xì)胞樣本單獨(dú)計(jì)算耦合γ的方法不同，研究者們采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)學(xué)習(xí)一個(gè)參數(shù)化的最優(yōu)傳輸映射。該參數(shù)化最優(yōu)傳輸映射可作為穩(wěn)健的預(yù)測(cè)器，用于預(yù)測(cè)未見(jiàn)過(guò)的n'個(gè)樣本例如來(lái)自其他患者的樣本）在擾動(dòng)后的細(xì)胞分布變化。

最優(yōu)傳輸映射的參數(shù)化。為了提出一種高效的最優(yōu)傳輸映射學(xué)習(xí)策略，研究者們基于諾特[62]和布雷尼爾[63]的經(jīng)典研究成果展開(kāi)，這些成果建立了最優(yōu)傳輸原始問(wèn)題(2)與對(duì)偶問(wèn)題(3)最優(yōu)解之間的聯(lián)系。由于凸共軛函數(shù)f*的計(jì)算難度極大，馬克瓦等人提出用另一個(gè)凸函數(shù)g來(lái)近似式(4)中的f*，進(jìn)而推導(dǎo)得到一個(gè)關(guān)于兩個(gè)凸函數(shù)的極大極小優(yōu)化公式（參考文獻(xiàn)18的定理3.3），其形式如下：

該方法的核心思想源于如下事實(shí)：

可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于任意函數(shù)g，均滿足，當(dāng)且僅當(dāng)g=f*時(shí)等號(hào)成立（參考文獻(xiàn)18的定理3.3）。為了學(xué)習(xí)得到最優(yōu)傳輸映射，也就是求解式(6)中的極小化問(wèn)題，馬克瓦等人[18]采用輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[22]對(duì)兩個(gè)對(duì)偶變量g和f進(jìn)行參數(shù)化，得到的傳輸映射定義為g的梯度。研究者們通過(guò)交替進(jìn)行極大極小優(yōu)化來(lái)求解最優(yōu)傳輸映射T*，其優(yōu)化過(guò)程如下：

其中，θ和Φ分別為兩個(gè)輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)。

基于CellOT預(yù)測(cè)擾動(dòng)效應(yīng)。上述框架能夠幫助研究者們建立對(duì)照組細(xì)胞與擾動(dòng)組細(xì)胞之間的映射關(guān)系，從而揭示細(xì)胞在受到擾動(dòng)k后的響應(yīng)軌跡。給定一組擾動(dòng)K，同時(shí)獲取對(duì)照組分布ρc以及每種擾動(dòng)k∈K對(duì)應(yīng)的擾動(dòng)后分布ρk的樣本，CellOT通過(guò)求解式(7)來(lái)學(xué)習(xí)最優(yōu)對(duì)偶勢(shì)函數(shù)對(duì)。在得到每種擾動(dòng)k對(duì)應(yīng)的凸勢(shì)函數(shù)參數(shù)化模型后，CellOT通過(guò)來(lái)預(yù)測(cè)對(duì)照組細(xì)胞在擾動(dòng)k下的狀態(tài)變化，預(yù)測(cè)得到的擾動(dòng)后樣本服從分布。因此，CellOT提供了一種通用方法，可用于預(yù)測(cè)單細(xì)胞層面的狀態(tài)軌跡，并揭示異質(zhì)性細(xì)胞亞群結(jié)構(gòu)在外部因素影響下的演化規(guī)律。

神經(jīng)最優(yōu)傳輸。除了本文采用的方法外，已有多項(xiàng)研究探索了基于輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法，將其作為式(1)的一種快速且可擴(kuò)展的近似求解方案。塔格瓦伊等人[64]提出用輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)f進(jìn)行參數(shù)化，通過(guò)分步求解f*來(lái)計(jì)算式(4)，但該方法的計(jì)算成本極高。馬克瓦等人[18]（即本文所采用的方法）對(duì)該工作進(jìn)行了擴(kuò)展，采用另一個(gè)輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)g來(lái)近似f*，將原問(wèn)題轉(zhuǎn)化為關(guān)于兩個(gè)輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的極大極小優(yōu)化問(wèn)題（見(jiàn)式(7)）。此外，黃等人[57]受最優(yōu)傳輸理論的啟發(fā)，提出了一種基于輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的歸一化流參數(shù)化新方法。關(guān)于當(dāng)前各類神經(jīng)最優(yōu)傳輸求解器的詳細(xì)對(duì)比，可參考科羅廷等人的研究[65]。

局限性。單細(xì)胞表達(dá)譜分析能夠精細(xì)刻畫(huà)單個(gè)細(xì)胞的分子狀態(tài)，但這類檢測(cè)方法通常具有破壞性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分子特性的連續(xù)時(shí)間監(jiān)測(cè)。目前已有多種方法被提出，旨在從群體數(shù)據(jù)中揭示單個(gè)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，但這些方法都面臨一個(gè)共同的挑戰(zhàn)：細(xì)胞狀態(tài)的時(shí)序分布可能由多種不同的基因調(diào)控動(dòng)力學(xué)機(jī)制產(chǎn)生。由于該問(wèn)題本身的不確定性，研究者們需要對(duì)細(xì)胞的潛在動(dòng)力學(xué)過(guò)程做出一定的假設(shè)。

本研究的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)源于一個(gè)生物學(xué)基本認(rèn)知，即擾動(dòng)會(huì)漸進(jìn)式地改變細(xì)胞的分子圖譜。該原理與最優(yōu)傳輸理論相契合，借鑒前人的研究工作[17]，研究者們將其作為CellOT模型的自然理論基礎(chǔ)。然而，當(dāng)這一基本假設(shè)不成立，即擾動(dòng)對(duì)細(xì)胞群體造成了嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生無(wú)法識(shí)別的改變時(shí)，CellOT及其他同類方法的性能都會(huì)下降（詳見(jiàn)討論部分）。在這種情況下，需要更復(fù)雜的數(shù)學(xué)工具來(lái)進(jìn)行建模，但這類工具目前還無(wú)法擴(kuò)展到包含多個(gè)基因的場(chǎng)景[66]。因此，研究者們需要依賴高時(shí)間分辨率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，來(lái)捕捉連續(xù)時(shí)間點(diǎn)之間細(xì)胞狀態(tài)的顯著變化[67]。

此外，如果細(xì)胞系統(tǒng)在兩個(gè)連續(xù)的觀測(cè)快照之間存在旋轉(zhuǎn)或振蕩等動(dòng)態(tài)過(guò)程，而這些過(guò)程未被檢測(cè)手段捕獲，那么基于最優(yōu)傳輸?shù)哪Ｐ鸵约捌渌F(xiàn)有工具[68]都無(wú)法還原這類復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。這在一定程度上是由于研究者們當(dāng)前選擇的代價(jià)函數(shù)為歐氏距離（見(jiàn)式(2)），該選擇是綜合理論約束和實(shí)際性能表現(xiàn)后確定的。探索其他類型的代價(jià)函數(shù)將作為研究者們未來(lái)的研究方向。

除此之外，當(dāng)前模型無(wú)法還原除細(xì)胞遷移外其他導(dǎo)致細(xì)胞分布隨時(shí)間變化的因素，例如細(xì)胞增殖和凋亡[67]。不過(guò)，已有最新研究提出了對(duì)經(jīng)典神經(jīng)最優(yōu)傳輸框架的擴(kuò)展方案，能夠?qū)⒓?xì)胞的生死過(guò)程納入建模范疇[69]。

最后，當(dāng)前生物工程技術(shù)的發(fā)展正致力于突破破壞性細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)的局限性。陳等人[70]提出了一種能夠保持細(xì)胞活性的轉(zhuǎn)錄組分析方法。溫雷布等人[46]通過(guò)條形碼技術(shù)在克隆層面建立細(xì)胞與其子代細(xì)胞之間的聯(lián)系，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞分化過(guò)程的追蹤。這些技術(shù)能夠提供單細(xì)胞的時(shí)間軌跡信息（盡管通量較低），即實(shí)現(xiàn)不同觀測(cè)快照之間的細(xì)胞對(duì)應(yīng)關(guān)系對(duì)齊。索姆納特等人[52]提出了一種與最優(yōu)傳輸理論相關(guān)的新型算法框架，能夠有效利用這類（部分）對(duì)齊的數(shù)據(jù)集[71,72]。

通過(guò)最優(yōu)傳輸映射預(yù)測(cè)擾動(dòng)反應(yīng)

小分子藥物可通過(guò)改變信號(hào)級(jí)聯(lián)等方式對(duì)細(xì)胞表型產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，這些影響大多取決于擾動(dòng)發(fā)生的背景。鑒于細(xì)胞群體和組織中單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性，預(yù)測(cè)細(xì)胞反應(yīng)需理解背景塑造基因組活性及其對(duì)藥物反應(yīng)的規(guī)律。通過(guò)單細(xì)胞基因組學(xué)或多重成像技術(shù)測(cè)量的高維單細(xì)胞數(shù)據(jù)可提供這種背景信息，但僅能返回細(xì)胞群體的非配對(duì)或未對(duì)齊觀測(cè)數(shù)據(jù)。CellOT可利用此類非配對(duì)數(shù)據(jù)，學(xué)習(xí)擾動(dòng)后的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變。

形式上，將未擾動(dòng)的對(duì)照群體表示為ρc，由n個(gè)細(xì)胞xi（i=1,...,n）組成。在施加擾動(dòng)k后，未擾動(dòng)群體中每個(gè)細(xì)胞xi的多變量狀態(tài)發(fā)生變化，將其觀測(cè)為擾動(dòng)群體ρk（圖1a）。為理解擾動(dòng)的作用方式和效果，研究者通過(guò)參數(shù)化映射Tk（見(jiàn)圖1a,b）學(xué)習(xí)群體ρc和ρk之間的轉(zhuǎn)變和對(duì)齊，該映射解釋了每個(gè)細(xì)胞從未擾動(dòng)細(xì)胞群體ρc在接受干預(yù)k后轉(zhuǎn)變?yōu)槠鋽_動(dòng)狀態(tài)ρk的過(guò)程。盡管源自不同觀測(cè)，映射Tk仍能為每個(gè)細(xì)胞xi確定擾動(dòng)群體中最可能對(duì)應(yīng)的細(xì)胞Tk(xi)（圖1c）。找到該映射不僅能建模擾動(dòng)后的單細(xì)胞軌跡，還能預(yù)測(cè)未見(jiàn)過(guò)的對(duì)照細(xì)胞的擾動(dòng)狀態(tài)。因此，可通過(guò)將學(xué)習(xí)到的映射Tk應(yīng)用于新的未擾動(dòng)群體ρc'，預(yù)測(cè)擾動(dòng)k的結(jié)果（圖1d）。

圖1 | CellOT模型概述。a，單細(xì)胞分布在未處理的對(duì)照狀態(tài)（ρc）或多種擾動(dòng)狀態(tài)之一（ρk、ρl、ρm等）下進(jìn)行測(cè)量，這些分布位于所分析特征的高維空間中。b，對(duì)于擾動(dòng)k，旨在用函數(shù)Tk對(duì)其建模，該函數(shù)將ρc中的未處理細(xì)胞映射到ρk中的處理后對(duì)應(yīng)細(xì)胞。c，缺乏配對(duì)測(cè)量時(shí)，研究者們假設(shè)擾動(dòng)在最小努力原則下將ρc轉(zhuǎn)化為ρk，具體而言，利用最優(yōu)傳輸理論學(xué)習(xí)Tk，將這種分布映射直接估計(jì)為最優(yōu)傳輸對(duì)偶勢(shì)的梯度?θ。d，為所有擾動(dòng)獨(dú)立學(xué)習(xí)最優(yōu)傳輸映射，由于這些映射完全參數(shù)化，例如，CellOT可在一組初始提供的樣本上訓(xùn)練，進(jìn)而對(duì)來(lái)自新的、未見(jiàn)過(guò)樣本的未處理細(xì)胞進(jìn)行預(yù)測(cè)。

研究者們尋求的對(duì)齊對(duì)照和擾動(dòng)群體的最優(yōu)映射Tk，應(yīng)能最好地描述施加擾動(dòng)k后每個(gè)細(xì)胞多變量特征的漸進(jìn)式變化。利用最優(yōu)傳輸[23, 24]恢復(fù)這些映射并揭示單細(xì)胞重編程軌跡，已被提出作為單細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的強(qiáng)有力建模假設(shè)[16, 17, 25-28]。最優(yōu)傳輸問(wèn)題返回分布ρc和ρk之間的對(duì)齊，對(duì)應(yīng)于對(duì)齊分子特征之間的最小總體成本，從而確定每個(gè)細(xì)胞在擾動(dòng)后的最可能狀態(tài)（圖1c）。學(xué)習(xí)Tk使其圖像對(duì)應(yīng)于ρk，且質(zhì)量根據(jù)最小努力原則從ρc轉(zhuǎn)移到ρk。由于直接參數(shù)化最優(yōu)傳輸映射Tk[20, 21, 29]不穩(wěn)定[18]，通過(guò)輸入凸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)最優(yōu)傳輸對(duì)偶問(wèn)題的凸勢(shì)f和g進(jìn)行參數(shù)化，并利用凸函數(shù)gk的梯度（?gk）[18]恢復(fù)最優(yōu)映射Tk。補(bǔ)充部分A.3詳細(xì)綜述了為單細(xì)胞生物學(xué)問(wèn)題提出的最優(yōu)傳輸方法，以及本文方法與先前方法的差異。

為全面評(píng)估CellOT的性能，研究者們將其與基于自動(dòng)編碼器的當(dāng)前最先進(jìn)方法[12, 13]進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，這些方法試圖通過(guò)操縱學(xué)習(xí)到的潛表征添加擾動(dòng)效果（補(bǔ)充部分A.1有綜述）。為進(jìn)一步驗(yàn)證最優(yōu)傳輸建模先驗(yàn)的假設(shè)，研究者們將每個(gè)擾動(dòng)k的學(xué)習(xí)到的最優(yōu)傳輸映射nabla gk與簡(jiǎn)單的非基于最優(yōu)傳輸?shù)膶?duì)齊進(jìn)行比較。

CellOT性能優(yōu)于現(xiàn)有最先進(jìn)方法

研究者們應(yīng)用CellOT，利用包含兩種黑色素瘤細(xì)胞系（M130219和M130429）的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集（通過(guò)迭代間接免疫熒光成像技術(shù)（4i）[5]分析）和單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集[31]（分別包含34種和9種不同治療方法），預(yù)測(cè)細(xì)胞群體對(duì)癌癥治療的反應(yīng)。數(shù)據(jù)集詳情見(jiàn)在線方法。研究者們將CellOT與兩種基于自動(dòng)編碼器的工具（scGEN和cAE[12]）以及PopAlign（一種基于通過(guò)高斯密度混合近似的對(duì)照和處理空間亞群對(duì)齊的方法）進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試。由于單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的高維特性，研究者們?cè)谧詣?dòng)編碼器學(xué)習(xí)到的潛表征上應(yīng)用CellOT。兩種4i治療和兩種單細(xì)胞RNA測(cè)序治療的觀測(cè)與預(yù)測(cè)細(xì)胞群體的邊緣分布如圖2a,d所示，每種擾動(dòng)選擇兩個(gè)特征，完整邊緣分布集見(jiàn)補(bǔ)充圖1-4。自動(dòng)編碼器基線傾向于捕捉處理后細(xì)胞群體的均值，但在匹配擾動(dòng)群體的所有異質(zhì)性狀態(tài)（擾動(dòng)群體的高階矩）方面效果不佳，因此這些模型往往學(xué)習(xí)過(guò)度簡(jiǎn)化的擾動(dòng)效果，難以滿足理解異質(zhì)性而非平均細(xì)胞行為的需求。而CellOT能捕捉這些高階矩，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確且細(xì)致的預(yù)測(cè)。

這可通過(guò)分布度量（如最大均值差異（MMD）[33]）進(jìn)一步量化。較小的最大均值差異值意味著兩個(gè)分布的所有矩均匹配，因此能精細(xì)捕捉擾動(dòng)細(xì)胞的整個(gè)分布，而非僅局限于群體平均（在線方法有詳細(xì)說(shuō)明）。所選擾動(dòng)的預(yù)測(cè)群體與觀測(cè)群體之間的最大均值差異如圖2b,e所示。對(duì)于單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，最大均值差異評(píng)估使用前50個(gè)標(biāo)志物基因進(jìn)行，所選標(biāo)志物基因數(shù)量的影響分析見(jiàn)補(bǔ)充圖7。除自動(dòng)編碼器基線外，研究者們還納入簡(jiǎn)單的恒等基線（僅通過(guò)返回未處理狀態(tài)預(yù)測(cè)治療效果）以及理論下限（觀測(cè)值，由一組不同的觀測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞組成，與真實(shí)預(yù)測(cè)的差異僅源于實(shí)驗(yàn)噪聲）。結(jié)果表明，CellOT可接近下限（觀測(cè)設(shè)置），而基線方法通常相比恒等設(shè)置無(wú)明顯改進(jìn)。

圖2 | CellOT在不同數(shù)據(jù)模態(tài)上優(yōu)于當(dāng)前最先進(jìn)方法。a–f，通過(guò)4i（a）和單細(xì)胞RNA測(cè)序（d）分析的細(xì)胞標(biāo)志物基因表達(dá)的邊緣分布（x軸）。觀測(cè)到的對(duì)照和處理狀態(tài)分別以淺藍(lán)色和深藍(lán)色顯示，CellOT預(yù)測(cè)結(jié)果以紅色顯示，基線預(yù)測(cè)結(jié)果（scGEN、cAE和PopAlign）以灰色顯示?；诜植季嚯x MMD（最大均值差異）以及觀測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞與預(yù)測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞之間的平均相關(guān)系數(shù)r2，對(duì)4i（b）和單細(xì)胞RNA測(cè)序（e）數(shù)據(jù)的模型進(jìn)行比較。誤差棒表示測(cè)試集十次自舉抽樣的標(biāo)準(zhǔn)差，虛線對(duì)應(yīng)恒等和觀測(cè)性能的中位數(shù)。4i（c）和單細(xì)胞RNA測(cè)序（f）數(shù)據(jù)的觀測(cè)處理細(xì)胞與各模型預(yù)測(cè)細(xì)胞的聯(lián)合UMAP嵌入。投影在聯(lián)合細(xì)胞集上計(jì)算，通過(guò)下采樣使觀測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞（灰色）和預(yù)測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞（藍(lán)色）數(shù)量相等。恒等映射用于比較處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞。分析針對(duì)曲美替尼、伊馬替尼和加維諾司他三種藥物進(jìn)行，4i數(shù)據(jù)使用M130219和M130429細(xì)胞系生成（在線方法）。

所有35種4i療法和6種單細(xì)胞RNA測(cè)序療法的不同評(píng)估指標(biāo)總結(jié)于補(bǔ)充圖5和6。除最大均值差異外，研究者們還納入均值，用于測(cè)量所有特征上觀測(cè)與預(yù)測(cè)平均藥物效果之間的距離。最后，研究者們比較了所有特征上預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)與觀測(cè)數(shù)據(jù)之間的總體平均相關(guān)系數(shù)r2（在線方法）。在所有治療中，CellOT在這兩項(xiàng)指標(biāo)上均優(yōu)于基線，通常高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。研究者們認(rèn)為CellOT的出色性能源于其能夠通過(guò)最優(yōu)傳輸理論，學(xué)習(xí)明確考慮細(xì)胞群體數(shù)據(jù)幾何結(jié)構(gòu)的傳輸函數(shù)。這一假設(shè)得到以下觀察結(jié)果的支持：處理后和未處理群體之間的特征間相關(guān)結(jié)構(gòu)在很大程度上保持不變，這正是最優(yōu)傳輸方法的優(yōu)勢(shì)場(chǎng)景。詳情見(jiàn)擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖1，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2可視化了學(xué)習(xí)到的映射，進(jìn)一步證明了CellOT建模精細(xì)反應(yīng)的能力。

最后，研究者們利用全特征空間，對(duì)預(yù)測(cè)和觀測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞的聯(lián)合集進(jìn)行了UMAP嵌入（UMAP）[34]（圖2c,f）。結(jié)果顯示，CellOT推斷的擾動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)與觀測(cè)到的擾動(dòng)細(xì)胞高度整合，而兩種基線均無(wú)法完整恢復(fù)擾動(dòng)分布，因此無(wú)法一致捕捉不同亞群的擾動(dòng)狀態(tài)。

CellOT捕捉藥物反應(yīng)中的細(xì)胞間變異性

捕捉同一樣本中不同細(xì)胞類型的不同擾動(dòng)反應(yīng)仍是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的計(jì)算任務(wù)。為降低任務(wù)復(fù)雜性，預(yù)測(cè)算法可在擾動(dòng)和未擾動(dòng)狀態(tài)下通過(guò)預(yù)定義的細(xì)胞類型標(biāo)簽進(jìn)行指導(dǎo)[32]，或設(shè)置為近似平均藥物反應(yīng)[13]。但這些簡(jiǎn)化存在代價(jià)：依賴于對(duì)現(xiàn)有相關(guān)細(xì)胞類型的先驗(yàn)知識(shí)，假設(shè)細(xì)胞類型在擾動(dòng)前后具有相同特征，且同一細(xì)胞類型內(nèi)藥物反應(yīng)一致。在最壞情況下，這些局限性可能掩蓋真實(shí)且重要的藥物反應(yīng)異質(zhì)性，阻礙發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)特異性擾動(dòng)反應(yīng)（補(bǔ)充圖13提供進(jìn)一步比較）。CellOT無(wú)這些局限性，能讓科學(xué)家以最適合解答其生物學(xué)問(wèn)題的粒度查詢預(yù)測(cè)的單細(xì)胞反應(yīng)。作為概念驗(yàn)證，研究者們將上述患者來(lái)源的黑色素瘤細(xì)胞系按等比例共培養(yǎng)（在線方法），并進(jìn)行定制藥物篩選——將細(xì)胞暴露于34種藥物中8小時(shí)，通過(guò)4i技術(shù)測(cè)量單細(xì)胞藥物反應(yīng)。利用CellOT，研究者們?yōu)槊糠N藥物預(yù)測(cè)了一組共享對(duì)照（二甲基亞砜（DMSO）處理）細(xì)胞的擾動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)（圖3a）。先前研究[7]表明，藥物處理后信號(hào)激酶的磷酸化水平與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。為評(píng)估預(yù)測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞與觀測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞中這種關(guān)系是否保持一致，研究者們利用CellOT學(xué)習(xí)到的每種藥物的傳輸映射，分析了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（pERK）的磷酸化水平。使用750個(gè)預(yù)測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞和750個(gè)觀測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞，研究者們基于除pERK外的所有特征聯(lián)合計(jì)算了UMAP嵌入。圖3b顯示了分別標(biāo)注每個(gè)細(xì)胞相應(yīng)pERK水平的預(yù)測(cè)群體和觀測(cè)群體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種投影的空間組織幾乎完全一致，且在兩類細(xì)胞和所有藥物處理中，pERK水平的分布高度相似（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3a,b和在線方法有進(jìn)一步分析）。

CellOT分離亞群特異性藥物效應(yīng)

通過(guò)計(jì)算預(yù)測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞與未處理對(duì)照細(xì)胞之間的差異，CellOT可分離每種藥物的作用方式。所有細(xì)胞的UMAP嵌入（按處理方式著色）能清晰區(qū)分不同處理（圖3c和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3e），CellOT能準(zhǔn)確學(xué)習(xí)所有這些差異（補(bǔ)充圖5）。而僅考慮平均擾動(dòng)效果時(shí)，不存在這種明顯的處理嵌入（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3d），這表明捕捉藥物反應(yīng)的細(xì)胞異質(zhì)性至關(guān)重要。

基于全特征集的萊頓聚類，研究者們將未擾動(dòng)對(duì)照細(xì)胞分為12種細(xì)胞狀態(tài)（圖3d、擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3g和在線方法）。細(xì)胞狀態(tài)1、5、6、9和12顯示出高M(jìn)elA水平且無(wú)SOX9，對(duì)應(yīng)黑色素細(xì)胞系M130429；而SOX9陽(yáng)性且MelA陰性的狀態(tài)2、3、4、7、8、10和11代表間充質(zhì)細(xì)胞系M130219（在線方法）?？傮w而言，M130429細(xì)胞的測(cè)量信號(hào)激酶磷酸化水平高于M130219；大多數(shù)藥物處理后仍保留典型的細(xì)胞狀態(tài)空間組織，且同一細(xì)胞系的細(xì)胞狀態(tài)聚類在一起（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3f）。

通過(guò)計(jì)算每種藥物的對(duì)照與處理狀態(tài)之間的差異（最優(yōu)傳輸成本），研究者們可進(jìn)一步表征藥物的作用強(qiáng)度。凋亡誘導(dǎo)劑（如星形孢菌素）、蛋白酶體抑制劑（如伊沙佐米和卡非佐米，或聯(lián)合治療卡非佐米+泊馬度胺+地塞米松）、微管穩(wěn)定劑（如紫杉醇）、c-Met抑制劑（如克唑替尼）以及多種酪氨酸激酶（如c-KIT和Bcr-Abl）的ATP競(jìng)爭(zhēng)劑（達(dá)沙替尼）顯示出高傳輸成本，因此在所有細(xì)胞狀態(tài)中均產(chǎn)生顯著的特征變化（圖3e）。其他藥物在8小時(shí)孵育期內(nèi)顯示出較弱的效果。研究者們發(fā)現(xiàn)，除達(dá)沙替尼外，所有擾動(dòng)均在兩種細(xì)胞系的多種細(xì)胞狀態(tài)中增加了凋亡標(biāo)志物切割型半胱天冬酶3的水平（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3k）；達(dá)沙替尼僅在與M130429相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)5、6、9和12中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡（圖3f）。

Smith等人[35]的先前研究報(bào)道，M130429細(xì)胞在MEK抑制劑（MEKi）和RAF抑制劑（RAFi）處理后代謝活性降低，而M130219細(xì)胞對(duì)這些抑制劑具有抗性。以pERK和pAKT作為相應(yīng)讀數(shù)，比較兩種細(xì)胞系對(duì)曲美替尼（MEKi）和MLN2480（泛RAFi）在MEK和PI3K通路中的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MEKi敏感的M130429細(xì)胞下調(diào)pAKT和pERK，而MEKi抗性的M130219細(xì)胞僅下調(diào)pERK。一致地，MLN2480處理也產(chǎn)生了類似的差異藥物反應(yīng)（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3i）。這表明MEK和PI3K通路的解偶聯(lián)可能賦予對(duì)MEK和Raf抑制劑的抗性，并構(gòu)成癌癥治療逃逸的適應(yīng)機(jī)制[36]。當(dāng)分析曲美替尼（MEKi）和達(dá)拉非尼（BRAFi）聯(lián)合處理后的pAKT和pERK水平時(shí)，研究者們發(fā)現(xiàn)了更多通路串?dāng)_改變的支持證據(jù)。

針對(duì)兩種作用于MEK通路的藥物，研究者們觀察到兩種細(xì)胞系的pERK均降低，但在MEKi抗性細(xì)胞系M130219（患者預(yù)先暴露于MEKi期間獲得抗性）中發(fā)現(xiàn)pAKT水平升高（圖3f）。這一發(fā)現(xiàn)表明，M130219在MEKi治療期間獲得了補(bǔ)償性反饋機(jī)制——MEK通路的抑制（量化為pERK降低）會(huì)促進(jìn)PI3K通路的信號(hào)傳導(dǎo)，可能通過(guò)激活上游受體激酶[37]實(shí)現(xiàn)。研究者們對(duì)兩種共培養(yǎng)的原代黑色素瘤細(xì)胞系在多種抗癌藥物處理下的研究結(jié)果表明，CellOT無(wú)需預(yù)定義細(xì)胞系標(biāo)簽，通過(guò)納入潛在的細(xì)胞間變異性，可準(zhǔn)確捕捉未擾動(dòng)細(xì)胞群體的表型異質(zhì)性，并預(yù)測(cè)多樣化的藥物反應(yīng)。

圖3 | CellOT助力癌癥藥物的多重單細(xì)胞表征。a，CellOT訓(xùn)練和預(yù)測(cè)設(shè)置。訓(xùn)練34個(gè)CellOT模型，每種藥物擾動(dòng)對(duì)應(yīng)一個(gè)模型，隨后每個(gè)模型用于從一組常見(jiàn)的未見(jiàn)過(guò)對(duì)照細(xì)胞中預(yù)測(cè)擾動(dòng)細(xì)胞。b，基于34種擾動(dòng)的同等數(shù)量預(yù)測(cè)細(xì)胞和測(cè)量細(xì)胞構(gòu)建的UMAP嵌入。點(diǎn)表示細(xì)胞，顏色表示測(cè)得的pERK強(qiáng)度。AU，任意單位。c，使用預(yù)測(cè)細(xì)胞的單細(xì)胞擾動(dòng)效果的UMAP嵌入。點(diǎn)對(duì)應(yīng)細(xì)胞，按藥物處理著色（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3提供完整圖例，在線方法提供單細(xì)胞擾動(dòng)效果計(jì)算方法）。d，對(duì)照細(xì)胞中鑒定的細(xì)胞狀態(tài)（在線方法）。每列代表一種細(xì)胞狀態(tài)，橫軸為基于與M130219和M130429細(xì)胞系關(guān)聯(lián)排序的細(xì)胞狀態(tài)，縱軸為細(xì)胞特征（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3提供完整特征集）。圓圈的大小和色調(diào)根據(jù)特征值縮放。e，每種細(xì)胞狀態(tài)的藥物處理傳輸成本（TC）聚類圖（主熱圖，藍(lán)-黃配色方案）、每種藥物所有狀態(tài)的傳輸成本總和（熱圖左側(cè)第一列，紫色）、每種藥物傳輸成本的變異系數(shù)（CV）（熱圖左側(cè)第二列，綠色）以及基于藥物細(xì)胞狀態(tài)傳輸成本層次聚類的樹(shù)狀圖。細(xì)胞狀態(tài)按d中的方式排序。f，細(xì)胞狀態(tài)特異性藥物反應(yīng)。（i）達(dá)沙替尼（上）。（ii）曲美替尼+達(dá)拉非尼（下）。c中UMAP嵌入的條件聚焦放大圖（左上）；與左上相同但按細(xì)胞狀態(tài)分配著色（右上）；列代表細(xì)胞狀態(tài)（cs），行顯示突出特征（下）。“cell-”代表平均細(xì)胞強(qiáng)度。圓圈根據(jù)藥物效果大小縮放，效果越強(qiáng)圓圈越大。負(fù)值以藍(lán)色色調(diào)編碼，正值以紅色色調(diào)編碼。

CellOT精準(zhǔn)推斷未見(jiàn)過(guò)患者的細(xì)胞反應(yīng)

CellOT學(xué)習(xí)到的治療前后分子狀態(tài)之間的映射，有助于更好地理解對(duì)特定藥物有反應(yīng)的細(xì)胞與無(wú)反應(yīng)細(xì)胞之間的差異。這對(duì)于推斷新患者的藥物反應(yīng)以及細(xì)胞間變異性高的場(chǎng)景至關(guān)重要。但要對(duì)未見(jiàn)過(guò)的患者進(jìn)行預(yù)測(cè)，需證明學(xué)習(xí)到的映射T能連貫且穩(wěn)健地建模不同患者的擾動(dòng)反應(yīng)，同時(shí)為每個(gè)患者預(yù)測(cè)個(gè)性化治療結(jié)果，而非僅提供群體平均結(jié)果。為測(cè)試CellOT在這種樣本外（o.o.s.）場(chǎng)景中的泛化能力，研究者們使用外周血單個(gè)核細(xì)胞液滴單細(xì)胞RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集。Kang等人[38]表征了8名狼瘡患者對(duì)β干擾素（IFN-β）反應(yīng)的細(xì)胞類型特異性和個(gè)體間變異性——β干擾素是一種強(qiáng)效細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的基因組規(guī)模變化。下文比較了CellOT和其他基線在獨(dú)立同分布（i.i.d.）場(chǎng)景（模型可見(jiàn)所有患者的細(xì)胞）和樣本外場(chǎng)景（模型不可見(jiàn)特定未參與訓(xùn)練患者的細(xì)胞）中的性能（圖4a）。

與先前分析一致，研究者們?cè)u(píng)估了CellOT捕捉不同標(biāo)志物基因從對(duì)照到β干擾素處理細(xì)胞的整體表達(dá)變化的準(zhǔn)確性，進(jìn)而評(píng)估預(yù)測(cè)的基因表達(dá)邊緣分布與處理群體的對(duì)齊程度（圖4b）。研究者們選擇CXCL11、CCL2和APOBEC3A基因，因?yàn)樗鼈兣c自身免疫性疾?。òㄏ到y(tǒng)性紅斑狼瘡）[39, 40]相關(guān)，因此是狼瘡患者治療中潛在的治療靶點(diǎn)，也可能適用于其他干擾素病[39-43]。這些選定基因從對(duì)照到擾動(dòng)群體的表達(dá)發(fā)生顯著變化，部分在擾動(dòng)后表現(xiàn)出雙峰基因表達(dá)譜。與CellOT不同，基線無(wú)法準(zhǔn)確預(yù)測(cè)這些基因的顯著轉(zhuǎn)錄組變化。受β干擾素處理強(qiáng)烈影響的其他基因的擴(kuò)展分析見(jiàn)補(bǔ)充圖9和10。

所有模型（包括CellOT）使用基于患者隊(duì)列訓(xùn)練的廣義擾動(dòng)模型TL，并以未見(jiàn)過(guò)患者的對(duì)照細(xì)胞為輸入，建模新患者的治療結(jié)果時(shí)，性能幾乎無(wú)下降。通過(guò)最大均值差異度量比較預(yù)測(cè)群體與觀測(cè)值，這一點(diǎn)尤為明顯。圖4c顯示了將每位患者分別作為未參與訓(xùn)練集的匯總結(jié)果，其他評(píng)估指標(biāo)（包括特征均值）見(jiàn)補(bǔ)充圖8。在獨(dú)立同分布和樣本外場(chǎng)景中，CellOT均優(yōu)于先前的基線，且在泛化到未見(jiàn)過(guò)患者時(shí)性能下降更?。ㄑa(bǔ)充圖11有更多結(jié)果）。這些結(jié)果表明，學(xué)習(xí)到的最優(yōu)傳輸映射能正確建模所有患者中存在的細(xì)胞亞群結(jié)構(gòu)變化，因此樣本外性能穩(wěn)健。研究者們對(duì)包含7名患者的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤隊(duì)列重復(fù)了相同評(píng)估[44]；但由于隊(duì)列規(guī)模小且個(gè)體反應(yīng)差異大，CellOT和所有基線在該場(chǎng)景中的泛化均面臨困難，完整分析見(jiàn)擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6。

CellOT 可跨物種重建固有免疫反應(yīng)

固有免疫反應(yīng)是一種細(xì)胞內(nèi)在防御程序，反應(yīng)細(xì)胞間具有高度異質(zhì)性，因此是評(píng)估CellOT能力的理想任務(wù)。研究者們的分析基于Hagai等人[45]收集的數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集研究了不同物種（包括豬、兔、小鼠和大鼠）單核吞噬細(xì)胞先天免疫程序的進(jìn)化。通過(guò)脂多糖（LPS）刺激這些原代骨髓來(lái)源細(xì)胞，下文測(cè)試了CellOT和基線在重建訓(xùn)練期間未接觸過(guò)的物種的先天免疫反應(yīng)方面的性能。研究者們將這種泛化任務(wù)稱為分布外（o.o.d.）任務(wù)，因?yàn)榕c樣本外場(chǎng)景不同，不同物種的反應(yīng)預(yù)計(jì)存在顯著差異（圖4d）。未參與訓(xùn)練集由大鼠或小鼠來(lái)源的細(xì)胞組成，擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4a,b分析了跨物種相似性及選擇未參與訓(xùn)練集的原因。

事實(shí)上，在獨(dú)立同分布和分布外場(chǎng)景中，CellOT均能準(zhǔn)確重建小鼠和大鼠的先天免疫反應(yīng)。這一點(diǎn)不僅通過(guò)更精確捕捉脂多糖添加后顯示高差異表達(dá)的標(biāo)志物基因（如Nfkb1（NF-κB）、Oasl1（Oasl1）、Mmp12和Cxcl5）的平均表達(dá)水平得以體現(xiàn)（圖4e和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4c,d），還通過(guò)分布外預(yù)測(cè)與未參與訓(xùn)練觀測(cè)值在所有基因上的平均相關(guān)系數(shù)r2得以驗(yàn)證（圖4f）。特別是，分析每種方法捕捉不同物種固有免疫反應(yīng)異質(zhì)性的能力時(shí)，CellOT優(yōu)于基線，表現(xiàn)為較低的最大均值差異（圖4f）。最值得注意的是，研究者們的方法顯示出上述標(biāo)志物基因表達(dá)邊緣的高度對(duì)齊——這些基因在擾動(dòng)后表現(xiàn)出復(fù)雜的雙峰表達(dá)譜（圖4g）。

CellOT將分化結(jié)果擴(kuò)展至低潛能細(xì)胞

在發(fā)育過(guò)程中，干細(xì)胞和祖細(xì)胞經(jīng)歷一系列命運(yùn)決定層級(jí)，其特征是細(xì)胞持續(xù)分化，不斷完善自身特性，直至達(dá)到功能終末狀態(tài)。通過(guò)追蹤初始細(xì)胞群體的分化過(guò)程，CellOT可恢復(fù)單個(gè)分子細(xì)胞命運(yùn)決定和發(fā)育軌跡。

Weinreb等人[46]通過(guò)追蹤廣泛類別的寡能和多能祖細(xì)胞亞群，并在第2、4和6天觀察樣本，分析了造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的命運(yùn)潛能（圖4h）。本文測(cè)試了CellOT和其他基線學(xué)習(xí)第2天觀測(cè)細(xì)胞向第4和6天（合并）觀測(cè)細(xì)胞分化過(guò)程的能力，以及在不同亞群間的泛化能力（分布外場(chǎng)景）。研究者們訓(xùn)練了兩個(gè)映射：映射To僅在寡能細(xì)胞上訓(xùn)練，Tm在多能細(xì)胞上訓(xùn)練。這些映射的獨(dú)立同分布版本在寡能和多能細(xì)胞上均進(jìn)行訓(xùn)練，因此每組獨(dú)立同分布和分布外映射在相同測(cè)試集上進(jìn)行評(píng)估。使用最大均值差異度量比較預(yù)測(cè)與觀測(cè)分化細(xì)胞狀態(tài)的分布距離，結(jié)果表明，在獨(dú)立同分布場(chǎng)景中，CellOT在寡能和多能子集上均優(yōu)于當(dāng)前最先進(jìn)方法（圖4i）。此外，盡管基線在兩種分布外場(chǎng)景中均表現(xiàn)不佳，但CellOT能在一個(gè)方向上泛化其預(yù)測(cè)（從多能細(xì)胞到寡能場(chǎng)景）。與寡能細(xì)胞不同，多能細(xì)胞具有更高的潛能，因此可能分化為更多細(xì)胞類型，因此研究者們預(yù)期Tm比在潛能較低的寡能細(xì)胞上訓(xùn)練的To更可能泛化。當(dāng)使用To預(yù)測(cè)多能細(xì)胞的發(fā)育擾動(dòng)時(shí)，無(wú)法恢復(fù)分化細(xì)胞命運(yùn)。

研究者們進(jìn)一步比較了不同時(shí)間點(diǎn)和不同細(xì)胞類型的性能。圖4j顯示了使用映射Tm分別對(duì)第4天和第6天細(xì)胞建模多能細(xì)胞發(fā)育的準(zhǔn)確性。顯然，CellOT在預(yù)測(cè)短程發(fā)育動(dòng)態(tài)時(shí)比預(yù)測(cè)時(shí)間上更遠(yuǎn)的狀態(tài)時(shí)結(jié)果更好（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5有更多結(jié)果）。這表明所有這些方法可能存在潛在局限性——難以在粗時(shí)間分辨率下恢復(fù)對(duì)齊。此外，盡管第4和6天的絕大多數(shù)細(xì)胞仍未分化（undiff），但部分細(xì)胞已分化為中性粒細(xì)胞（neut）、單核細(xì)胞（mono）、嗜堿性粒細(xì)胞（baso）、淋巴樣前體細(xì)胞（lymph）或樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）。正如預(yù)期，對(duì)于數(shù)據(jù)集中僅少量存在的細(xì)胞類型，CellOT的性能（以最大均值差異度量）有所下降（圖4k）。

圖4 | CellOT泛化到未見(jiàn)過(guò)的患者和細(xì)胞亞群。a–k，樣本外（a–c）和分布外（d–k）場(chǎng)景。a，8名狼瘡患者的細(xì)胞在未處理和β干擾素處理狀態(tài)下進(jìn)行測(cè)量。針對(duì)每個(gè)樣本，訓(xùn)練兩個(gè)模型：樣本外模型（基于所有其他樣本的細(xì)胞訓(xùn)練）和獨(dú)立同分布模型（額外使用未參與訓(xùn)練樣本的一半細(xì)胞訓(xùn)練，未顯示）。b，未參與訓(xùn)練樣本在獨(dú)立同分布（上）和樣本外（下）場(chǎng)景中的預(yù)測(cè)細(xì)胞邊緣分布。兩個(gè)模型的預(yù)測(cè)均在相同測(cè)試集上進(jìn)行（未用于訓(xùn)練兩個(gè)模型）。c，獨(dú)立同分布和樣本外場(chǎng)景中，所有未參與訓(xùn)練樣本的預(yù)測(cè)分布與觀測(cè)處理分布之間的最大均值差異分?jǐn)?shù)。箱線圖顯示中位數(shù)和四分位數(shù)。d，作為分布外任務(wù)，訓(xùn)練CellOT和基線預(yù)測(cè)不同物種對(duì)脂多糖的反應(yīng)，并以大鼠（或小鼠）作為未參與訓(xùn)練物種進(jìn)行測(cè)試。e，CellOT和scGEN對(duì)選定標(biāo)志物基因的獨(dú)立同分布和分布外預(yù)測(cè)的平均基因表達(dá)。f，CellOT和基線在分布外場(chǎng)景中r2相關(guān)特征均值和最大均值差異的性能比較。數(shù)據(jù)表示為測(cè)試集十次自舉抽樣的均值±標(biāo)準(zhǔn)差。g，以大鼠作為未參與訓(xùn)練物種訓(xùn)練時(shí)，顯示雙峰表達(dá)譜的標(biāo)志物基因的分布外預(yù)測(cè)邊緣分布。h，多能和寡能亞群的細(xì)胞在第2、4和6天進(jìn)行測(cè)量。僅基于多能細(xì)胞（Tm）或寡能細(xì)胞（To）訓(xùn)練時(shí)，應(yīng)用CellOT預(yù)測(cè)第2天細(xì)胞如何發(fā)育為第4和6天的合并集。然后應(yīng)用Tm預(yù)測(cè)分布外寡能細(xì)胞，應(yīng)用To預(yù)測(cè)分布外多能細(xì)胞。與樣本外場(chǎng)景類似，訓(xùn)練獨(dú)立同分布模型，包括未參與訓(xùn)練亞群的一半。i，所有模型在分布外和獨(dú)立同分布預(yù)測(cè)任務(wù)中（第4和6天聯(lián)合）的預(yù)測(cè)與（觀測(cè)）發(fā)育分布之間的最大均值差異分?jǐn)?shù)。j，使用Tm時(shí)，CellOT在每個(gè)場(chǎng)景中對(duì)不同細(xì)胞類型預(yù)測(cè)第4天和第6天狀態(tài)的性能。k，第4和6天每種細(xì)胞類型的細(xì)胞數(shù)量和百分比。

本文提出CellOT框架，該框架利用神經(jīng)最優(yōu)傳輸技術(shù)，基于非配對(duì)的處理后與未處理細(xì)胞狀態(tài)建模單細(xì)胞擾動(dòng)反應(yīng)。通過(guò)從最優(yōu)傳輸視角充分建模問(wèn)題本質(zhì)，CellOT能夠確定擾動(dòng)對(duì)細(xì)胞特性的影響，重建單細(xì)胞在擾動(dòng)后的最可能軌跡，進(jìn)而助力深入理解細(xì)胞命運(yùn)決定的驅(qū)動(dòng)因素及細(xì)胞逃逸機(jī)制。CellOT借鑒了最優(yōu)傳輸技術(shù)近年來(lái)在單細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用成果[16,17]，引入了可應(yīng)用于未知新樣本的完全參數(shù)化傳輸映射。此前方法[19-21]依賴于原始最優(yōu)傳輸映射的無(wú)約束參數(shù)化，然而這類模型的無(wú)約束特性使穩(wěn)健優(yōu)化面臨挑戰(zhàn)，導(dǎo)致性能下降[18]。與之不同，研究者們通過(guò)對(duì)偶最優(yōu)傳輸問(wèn)題學(xué)習(xí)未擾動(dòng)到擾動(dòng)細(xì)胞狀態(tài)的轉(zhuǎn)換，該問(wèn)題通過(guò)一對(duì)受凸性約束的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行參數(shù)化[18]。這些約束構(gòu)成了重要的基于理論的歸納偏置，能夠促進(jìn)模型學(xué)習(xí)，最終形成可靠且易于訓(xùn)練的框架——CellOT在多個(gè)問(wèn)題中均展現(xiàn)出穩(wěn)定優(yōu)異的性能，且無(wú)需大量超參數(shù)調(diào)優(yōu)，這一事實(shí)也印證了上述優(yōu)勢(shì)（詳見(jiàn)在線方法）。

CellOT能夠推斷細(xì)胞群體對(duì)擾動(dòng)的高度復(fù)雜非線性演化過(guò)程，且無(wú)需對(duì)這些動(dòng)態(tài)過(guò)程的本質(zhì)做出強(qiáng)簡(jiǎn)化假設(shè)。與現(xiàn)有基于自動(dòng)編碼器的基線方法[12-14]不同，CellOT無(wú)需依賴學(xué)習(xí)有意義的低維嵌入空間，并將擾動(dòng)建模為該空間中的線性移位。研究者們通過(guò)對(duì)癌細(xì)胞系中不同藥物的單細(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)（結(jié)合RNA-seq和空間分辨4i測(cè)量技術(shù)）驗(yàn)證了這一優(yōu)勢(shì)，結(jié)果表明CellOT性能始終更優(yōu)（圖2及補(bǔ)充圖5）。研究者們的評(píng)估不僅局限于常用的平均治療效果和全細(xì)胞相關(guān)性分析，還通過(guò)邊緣分布分析和最大均值差異（MMD）分?jǐn)?shù)計(jì)算，對(duì)預(yù)測(cè)分布與觀測(cè)分布的匹配程度進(jìn)行了更嚴(yán)格的量化評(píng)估。

利用CellOT進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)感知藥物分析，研究者們能夠?qū)_動(dòng)效果量化為研究系統(tǒng)潛在異質(zhì)性的函數(shù)——本研究中即兩種對(duì)藥物敏感性不同的黑色素瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)體系。通過(guò)這種方式，研究者們優(yōu)化了所測(cè)藥物的反應(yīng)圖譜，揭示了與細(xì)胞系供體治療史相關(guān)的多信號(hào)通路細(xì)胞狀態(tài)特異性反應(yīng)。研究者們發(fā)現(xiàn)，預(yù)先暴露于MEK抑制劑的細(xì)胞中，MEK和PI3K通路的信號(hào)活性發(fā)生解偶聯(lián)，這是黑色素瘤細(xì)胞已知的治療逃逸適應(yīng)機(jī)制[36]。這種通路重連與細(xì)胞分子反饋結(jié)構(gòu)從效應(yīng)器向受體的轉(zhuǎn)變相關(guān)[36, 47]。因此，將CellOT與更多組合治療方案、多重成像技術(shù)及反映疾病適應(yīng)特性的細(xì)胞體系相結(jié)合，有望助力研究者們闡明癌癥治療背景下信號(hào)通路演化的分子機(jī)制。

研究者們進(jìn)一步分析了所學(xué)映射在訓(xùn)練樣本之外（樣本外場(chǎng)景）及不同樣本組成（分布外場(chǎng)景）中的泛化能力。如圖4所示，研究者們測(cè)試了CellOT預(yù)測(cè)未見(jiàn)過(guò)狼瘡患者治療反應(yīng)、推斷低潛能干細(xì)胞發(fā)育軌跡及跨患者轉(zhuǎn)換先天免疫反應(yīng)的能力。在所有場(chǎng)景中，CellOT的準(zhǔn)確性和精確性均優(yōu)于當(dāng)前最先進(jìn)方法（圖4）。此外，擾動(dòng)后的預(yù)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)與實(shí)際觀測(cè)細(xì)胞狀態(tài)仍高度接近。這些結(jié)果極具應(yīng)用前景，表明精準(zhǔn)的樣本外和分布外預(yù)測(cè)是切實(shí)可行的。

然而，分布外預(yù)測(cè)能力（如對(duì)未見(jiàn)過(guò)患者的預(yù)測(cè)）的實(shí)現(xiàn)需滿足兩個(gè)條件：（1）在未擾動(dòng)場(chǎng)景中已觀測(cè)到相似樣本；（2）訓(xùn)練集包含不僅未擾動(dòng)狀態(tài)相似、且擾動(dòng)反應(yīng)也相似的案例。對(duì)接受帕比司他治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的分析（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6a-c）證實(shí)了這一局限性：CellOT及基線方法能夠?qū)ξ磾_動(dòng)狀態(tài)和擾動(dòng)效果均與其他患者相似的病例預(yù)測(cè)治療結(jié)果（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6f），但無(wú)法捕捉表現(xiàn)出獨(dú)特反應(yīng)患者的擾動(dòng)效果（擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6g）。在分布外場(chǎng)景應(yīng)用CellOT時(shí)，這一局限性需重點(diǎn)考量。要解決此類問(wèn)題，需擴(kuò)大隊(duì)列規(guī)模、補(bǔ)充元信息并拓展方法學(xué)。Bunne等人[48]提出了一種神經(jīng)最優(yōu)傳輸方案，通過(guò)在預(yù)測(cè)擾動(dòng)反應(yīng)時(shí)納入上下文信息（如患者元數(shù)據(jù)），部分解決了這一問(wèn)題。

研究者們還觀察到，當(dāng)擾動(dòng)過(guò)強(qiáng)時(shí)（擾動(dòng)前后細(xì)胞分布差異極大），CellOT的預(yù)測(cè)性能會(huì)下降（圖4j），其他方法也出現(xiàn)了類似的性能下滑（補(bǔ)充圖12）。最優(yōu)傳輸理論的核心原理適用于急性細(xì)胞擾動(dòng)場(chǎng)景——在此類場(chǎng)景中，單細(xì)胞不會(huì)在多維測(cè)量空間中完全隨機(jī)重分布，通常僅在少數(shù)維度發(fā)生變化，因此整體相關(guān)結(jié)構(gòu)得以保留。當(dāng)通過(guò)規(guī)律且高頻的快照觀測(cè)擾動(dòng)反應(yīng)時(shí)，該建模假設(shè)可得到滿足；但當(dāng)擾動(dòng)反應(yīng)進(jìn)展過(guò)深時(shí)，分子轉(zhuǎn)換過(guò)程無(wú)法被重建。對(duì)于極強(qiáng)或極復(fù)雜的擾動(dòng)，細(xì)胞多重特征圖譜可能發(fā)生劇烈變化，違背最優(yōu)傳輸假設(shè)，導(dǎo)致難以基于最小努力原則重建未擾動(dòng)與擾動(dòng)群體間的對(duì)齊關(guān)系。在此類場(chǎng)景中，可能需要補(bǔ)充額外信息，例如潛在生物學(xué)模型或整合多個(gè)小時(shí)步觀測(cè)結(jié)果的模型。

盡管細(xì)胞命運(yùn)決定具有隨機(jī)性，且細(xì)胞動(dòng)態(tài)過(guò)程本質(zhì)上存在噪聲[49]，但CellOT仍將細(xì)胞反應(yīng)建模為確定性軌跡。此前研究表明，與確定性方法相比，將細(xì)胞命運(yùn)決定視為概率事件的方法能更充分地估計(jì)完整動(dòng)態(tài)模型[50]。近期研究[51, 52]通過(guò)將最優(yōu)傳輸與隨機(jī)差分方程相結(jié)合，可在CellOT基礎(chǔ)上考慮生物異方差性，但需以增加模型復(fù)雜性及引入其他簡(jiǎn)化假設(shè)為代價(jià)。

盡管研究者們通過(guò)深入分析所學(xué)映射的本質(zhì)，以及驗(yàn)證CellOT在多種應(yīng)用場(chǎng)景中的通用性，為其對(duì)不同數(shù)據(jù)模態(tài)下多種化學(xué)擾動(dòng)的建模能力提供了概念驗(yàn)證，但CellOT的泛化能力仍基于相對(duì)較小的數(shù)據(jù)集進(jìn)行評(píng)估。關(guān)鍵在于，由分子特征各異的患者（如具有不同潛在遺傳學(xué)特征的癌癥患者）組成的大型隊(duì)列，可能會(huì)產(chǎn)生高度異質(zhì)的治療反應(yīng)。顯然，針對(duì)這些挑戰(zhàn)的研究方法可充分利用即將出現(xiàn)的大規(guī)?；颊哧?duì)列研究數(shù)據(jù)。利用神經(jīng)最優(yōu)傳輸技術(shù)學(xué)習(xí)單細(xì)胞藥物反應(yīng)，為未來(lái)研究開(kāi)辟了廣闊前景，包括助力深化對(duì)細(xì)胞療法的理解、研究患者樣本的藥物反應(yīng)，以及在大規(guī)模藥物設(shè)計(jì)中更好地考慮細(xì)胞間變異性。

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細(xì)胞動(dòng)力學(xué)讀書(shū)會(huì)

細(xì)胞絕非孤立的單元，生命的智慧，如同蟻群的協(xié)作，涌現(xiàn)在細(xì)胞間復(fù)雜的相互作用之中。跨越臨界點(diǎn)，簡(jiǎn)單規(guī)則便能催生全新的、穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)與功能。

半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，復(fù)雜系統(tǒng)科學(xué)為我們提供了洞見(jiàn)生命現(xiàn)象的全新工具箱。本期活動(dòng)，我們將融合物理學(xué)、復(fù)雜科學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)，從Waddington景觀、自組織臨界，到反應(yīng)-擴(kuò)散模型與類器官實(shí)驗(yàn)，繪制一幅理解細(xì)胞命運(yùn)與群體動(dòng)力學(xué)的連貫地圖。

本次讀書(shū)會(huì)由李輝、王維康、韋曉慧三位學(xué)者及王艷博士共同發(fā)起，并沿兩條主線展開(kāi)：一是探討細(xì)胞命運(yùn)、多穩(wěn)態(tài)等理論核心；二是結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序、時(shí)序推斷等方法，學(xué)習(xí)如何將靜態(tài)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為動(dòng)態(tài)模型。

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