裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）作為一類產(chǎn)油真菌，其細(xì)胞中油脂含量可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的50%～70%，二十二碳六烯酸（DHA）更是可占到總脂肪酸的35%～55%，因此，作為生產(chǎn)油脂的工程潛力菌株，其脂質(zhì)代謝調(diào)控的相關(guān)途徑一直是被深入研究的熱點(diǎn)。目前研究最多和較為認(rèn)可的裂殖壺菌中油脂合成途徑主要涉及2 種：合成飽和脂肪酸（SFAs）的需氧脂肪酸合酶（FAS）途徑和合成多不飽和脂肪酸（PUFAs）的厭氧聚酮合酶（PKS）途徑，但是其明確的調(diào)控機(jī)制尚未完全清晰，因此，需要從油脂合成調(diào)控的不同維度進(jìn)行深入分析。

有研究表明，脂肪酸在裂殖壺菌中的存在方式分為2 種：游離形式的脂肪酸占極少部分，大多數(shù)是通過酯化反應(yīng)裝配到磷脂和甘油三酯（TAG）上進(jìn)行積累與儲(chǔ)存。Liu Ying等對Aurantiochytrium sp.PKU#SW7和Thraustochytriidae sp. PKU#Mn16發(fā)酵生產(chǎn)DHA的脂質(zhì)譜圖進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DHA主要分布在中性脂質(zhì)TAG中。裂殖壺菌中DHA盡管是以TAG的形式存在，但其合成后遷移到TAG的過程與磷脂的代謝密切相關(guān)。裂殖壺菌中磷脂可以通過Kennedy途徑進(jìn)行從頭合成（圖1），包含CDP-X磷脂合成途徑和CDP-甘油二酯（DAG）磷脂合成途徑；此外，磷脂還能經(jīng)由?；緩街苯雍铣?。以磷脂中極為常見的磷脂酰膽堿（PC），其可通過3-磷酸膽堿-甘油（GPC）歷經(jīng)兩步?；磻?yīng)得到。并且磷脂之間的轉(zhuǎn)化也很常見：PC可以通過磷脂酰乙醇胺（PE）轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)生成，PC也能夠轉(zhuǎn)化為溶血磷脂酰膽堿（LPC），磷脂酰絲氨酸（PS）與PC和PE之間也可以相互轉(zhuǎn)化。TAG的合成除了經(jīng)由Kennedy途徑，即通過二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT）對DAG的sn-3位點(diǎn)進(jìn)行?；@得，還可以通過磷脂二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（PDAT）和PC:二酰甘油膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶（PDCT）催化的PC代謝通路進(jìn)行合成。推測TAG中DHA的形成主要經(jīng)PC通路遷移轉(zhuǎn)化。由此可見，調(diào)控磷脂代謝會(huì)明顯影響裂殖壺菌的脂質(zhì)合成，這有利于闡明裂殖壺菌的油脂尤其是PUFAs的代謝調(diào)控機(jī)制。

磷脂是細(xì)胞膜的主要成分，影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性，磷脂的不同類型主要取決于其連接的疏水性脂肪?；満陀H水性磷酸極性基團(tuán)特性。PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；钚院退饣钚栽赥AG和磷脂的代謝轉(zhuǎn)化中具有重要作用。已有研究表明PLD對植物細(xì)胞的生長和油脂合成都會(huì)產(chǎn)生影響。Lee等通過RNA干擾的方式將大豆中PLDα的表達(dá)水平下調(diào)，結(jié)果顯示PC和PE中PUFAs的占比增加，但TAG的不飽和度降低，意味著PLDα的抑制減緩了磷脂向TAG的轉(zhuǎn)化。Yang Wenyu等在亞麻薺中將2 個(gè)擬南芥磷脂酶D基因（AtPLDζ1和AtPLDζ2）進(jìn)行了共表達(dá)，同時(shí)利用14C標(biāo)記的甘油和乙酸酯探究其油脂的組裝動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示新合成的脂肪酸優(yōu)先摻入到PC的sn-2位上，隨后TAG含量增加，PC脂肪酸含量降低，這表明PLD會(huì)使磷脂與甘油酯之間發(fā)生轉(zhuǎn)化。Bai Yang等在擬南芥中過表達(dá)了GmPLDγ基因以改變其甘油酯的代謝，GmPLDγ的表達(dá)會(huì)水解PC，使PC發(fā)生轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)了含有不飽和長鏈脂肪酸種子油的生產(chǎn)，增加產(chǎn)油量的同時(shí)也改變了油脂組成。目前微生物中關(guān)于PLD對油脂合成的影響研究甚少。Zhang Yiting等挖掘到了裂殖壺菌中PLD蛋白相關(guān)的2 個(gè)基因片段PLD1和PLD2，二者的調(diào)控對裂殖壺菌的代謝產(chǎn)生了不同的影響：PLD1基因的敲除對生物量和油脂產(chǎn)量影響不明顯，但提高了油脂中PUFAs的占比，其中DHA占比提高了13.3%；PLD2基因敲除后生物量降低了32.8%，油脂產(chǎn)量降低了17.6%，脂肪酸組成變化不大。這是由于二者的轉(zhuǎn)磷脂酰和水解活性偏好不同，PLD1的敲除加強(qiáng)了裂殖壺菌的磷脂合成通路，對磷脂的成分有一定影響，降低了PC占比，而提高了LPC和磷脂酰肌醇（PI）占比，有利于DHA與磷脂的裝配，從而提高DHA的積累。以上結(jié)果表明，通過PLD調(diào)控磷脂的代謝能有效影響油脂的合成。

相比其他來源的PLD，鏈霉菌來源的PLD具有較高的轉(zhuǎn)磷脂?；钚浴Ｒ虼?，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院的童俊、凌雪萍*、三峽公共檢驗(yàn)檢測中心的陸濤選擇將抗生鏈霉菌（Streptomyces antibioticus）來源的PLD基因（SaPLD）過表達(dá)于裂殖壺菌中，考察過表達(dá)PLD對裂殖壺菌細(xì)胞生長和油脂合成的影響?；诩?xì)胞膜形態(tài)分析PLD對細(xì)胞生長的影響，結(jié)合磷脂組學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分析PLD過表達(dá)對脂肪酸、磷脂與TAG的代謝影響，進(jìn)而探討PLD對裂殖壺菌的生長和油脂合成的代謝調(diào)控機(jī)制。

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SaPLD的密碼子優(yōu)化及過表達(dá)菌株的篩選

為實(shí)現(xiàn)鏈霉菌來源的SaPLD基因（GenBank登錄號：D16444.1）在裂殖壺菌SR21中的高效表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)裂殖壺菌的密碼子偏好性，在保持氨基酸序列不變的前提下，對SaPLD基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲得長度為1 527 bp的優(yōu)化序列。優(yōu)化后的SaPLD基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，并定向插入至pUCSP載體質(zhì)粒中，同時(shí)在基因兩端分別引入Xba I和Nhe I限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)。利用Xba I和Nhe I對重組質(zhì)粒pUC-SP-SaPLD進(jìn)行雙酶切鑒定（圖2A），回收目的基因片段后，將其連接至實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pBluzeo-18S過表達(dá)載體，成功構(gòu)建pBluzeo-SaPLD-18S重組表達(dá)載體（圖2B）。隨后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用含氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選（圖3A）。挑取單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR驗(yàn)證（圖3B）。結(jié)果顯示，陽性克隆菌株能夠特異性擴(kuò)增出SaPLD基因片段，初步證實(shí)目的基因已成功整合至pBluzeo-18S載體中。最后，委托廈門鉑瑞生物科技有限公司對陽性克隆進(jìn)行Sanger測序分析，測序結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了pBluzeo-SaPLD-18S過表達(dá)載體的成功構(gòu)建。

對成功構(gòu)建的pBluzeo- SaPLD -18S過表達(dá)載體質(zhì)粒實(shí)施PCR擴(kuò)增，獲取包含18S上下游同源臂、博來霉素抗性表達(dá)框及 SaPLD 表達(dá)框的線性化DNA片段。采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)，將該目的片段導(dǎo)入裂殖壺菌。以野生型裂殖壺菌菌株作為陰性對照，利用含博來霉素的抗性平板篩選電轉(zhuǎn)化后的菌株，成功分離獲得陽性轉(zhuǎn)化子（圖4A）。設(shè)計(jì)針對博來霉素抗性基因的特異性引物（擴(kuò)增片段長度375 bp），分別對野生型菌株和轉(zhuǎn)化菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測，并以pBluzeo- SaPLD -18S過表達(dá)載體質(zhì)粒作為陽性對照。如圖4B所示，野生型菌株基因組未擴(kuò)增出抗性基因條帶，而陽性轉(zhuǎn)化菌株則呈現(xiàn)出預(yù)期的375 bp特異性條帶。結(jié)果表明， SaPLD 基因已成功整合至裂殖壺菌基因組中，證實(shí) SaPLD 過表達(dá)菌株構(gòu)建成功。

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SaPLD過表達(dá)對裂殖壺菌及油脂積累的影響

如圖5A所示，野生型菌株在48 h開始進(jìn)入指數(shù)生長期，48～96 h期間生物量和油脂產(chǎn)量快速增長和積累，而后進(jìn)入穩(wěn)定期，油脂產(chǎn)量最高達(dá)到24.9 g/L。SaPLD過表達(dá)菌株在前72 h與野生型生長基本一致，72 h后生長變緩，比野生型延遲24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，最終生物量比野生型低7.9%。2 株菌的總油產(chǎn)量一直在逐步積累，96 h前過表達(dá)菌株低于野生型，但后期過表達(dá)菌株總油產(chǎn)量持續(xù)增加最終超過野生型，最高總油產(chǎn)量達(dá)到25.9 g/L，比野生型提高了4.0%。

由圖5B可知， SaPLD 過表達(dá)菌株的葡萄糖消耗速率更快，在96 h就基本耗盡；而野生型菌株在48 h前葡萄糖消耗速率較慢，生長相對較慢（48 h時(shí)生物量略低于過表達(dá)菌株），隨后糖消耗開始加快，在120 h耗完所有葡萄糖。盡管突變株的糖消耗較快，但并沒有體現(xiàn)在生物量的增加上，而相對是糖消耗較慢的野生型生長更佳，這說明 SaPLD 改變了細(xì)胞糖代謝的利用途徑。由圖5C可知，2 株菌的油脂占比均隨著細(xì)胞的生長而增加，前期野生型的油脂占比高于突變株，后期突變株高于野生型，可以看出 SaPLD 過表達(dá)最終提高了裂殖壺菌的油脂占比，最高值比野生菌株提高了13.5%，這說明 SaPLD 可以提高裂殖壺菌中單位細(xì)胞合成油脂的能力。更為重要的是，從48～72 h野生型的油脂占比提高了14.0%，而突變株提高了40.1%，結(jié)合葡萄糖的消耗速率和生物量的變化，可以看出 SaPLD 的過表達(dá)使得更多的碳源進(jìn)入脂質(zhì)合成途徑，從而最終提高了突變株的油脂含量。

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SaPLD過表達(dá)對細(xì)胞形態(tài)的影響

發(fā)酵培養(yǎng)過程中觀察到SaPLD過表達(dá)細(xì)胞在72 h出現(xiàn)破裂，取樣離心后上清液渾濁，漂浮著破碎的細(xì)胞，這說明SaPLD對宿主裂殖壺菌產(chǎn)生了一定程度的毒害作用。如圖6所示，野生型菌株細(xì)胞表面光滑，形態(tài)飽滿完整，而SaPLD過表達(dá)菌株細(xì)胞表面出現(xiàn)了皺縮、破裂的情況，細(xì)胞整體尺寸也略小于野生型細(xì)胞。這表明突變株細(xì)胞膜在SaPLD作用下功能受到影響，細(xì)胞無法正常生長繁殖。Mishima等發(fā)現(xiàn)當(dāng)重組的PLD表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞進(jìn)入誘導(dǎo)階段時(shí)，在PLD的毒性作用下幾乎所有的重組細(xì)胞都被迅速殺死，活細(xì)胞數(shù)從109以上急劇減少至103，顯示出PLD極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。張瑩在大腸桿菌表達(dá)鏈霉菌PLD時(shí)發(fā)現(xiàn)其對宿主的生長產(chǎn)生了明顯的毒害作用，影響了大腸桿菌BL21的生長速率，菌體濃度始終低于對照組。這表明PLD的過表達(dá)對宿主細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的毒害作用。

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NaCl脅迫對SaPLD過表達(dá)菌株生長和細(xì)胞形態(tài)的影響

PLD對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性與其引起細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)失衡及其磷脂代謝異常變化有關(guān)，而有學(xué)者認(rèn)為鹽脅迫作用可以緩解PLD對大腸桿菌的毒性，一定程度上可以抑制細(xì)胞發(fā)生裂解。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在大腸桿菌進(jìn)行PLD表達(dá)時(shí)，NaCl脅迫作用下大腸桿菌的生物量有所增加，這表明NaCl脅迫作用為大腸桿菌提供了某種保護(hù)，有助于細(xì)胞抵抗PLD產(chǎn)生的毒性，因此選擇鈉離子對其進(jìn)行脅迫研究。首先考察了不同濃度的NaCl對細(xì)胞生長和油脂合成的影響。如圖7A所示，隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加，SaPLD過表達(dá)菌株的總油產(chǎn)量有了進(jìn)一步的提升，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)，總油產(chǎn)量達(dá)到最高值（30.5 g/L），相比野生型菌株和未脅迫培養(yǎng)過表達(dá)菌株分別提高了27.3%和17.6%。在NaCl的脅迫作用下，SaPLD過表達(dá)菌株生物量也有所恢復(fù)，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)，生物量恢復(fù)到了野生型裂殖壺菌的生長水平（圖7B），這說明NaCl脅迫作用確實(shí)可以緩解PLD對裂殖壺菌的細(xì)胞膜毒性。裂殖壺菌作為海洋真菌，始終生存在鹽度較高的環(huán)境下，PLD的表達(dá)可能打破了細(xì)胞內(nèi)的離子平衡，而鈉離子可以維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓平衡和調(diào)節(jié)酸堿平衡，氯離子對嗜鹽菌株的生長有著至關(guān)重要的作用，因此添加一定量的NaCl可以起到緩解PLD的細(xì)胞毒性、促進(jìn)裂殖壺菌細(xì)胞生長的作用。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了在NaCl質(zhì)量濃度為12 g/L時(shí)突變株的生長代謝情況。如圖8A所示，脅迫培養(yǎng)菌株和未脅迫突變株在120 h前的生長趨勢基本一致，SaPLD-NaCl組的生物量一直略低于SaPLD組，而在120 h后SaPLDNaCl組生物量繼續(xù)增加，并在144 h超過SaPLD組，基本達(dá)到野生型菌株的生長水平；脅迫組的油脂產(chǎn)量也得到進(jìn)一步提高。由圖8B可知，在高濃度鹽脅迫下，SaPLD過表達(dá)菌株的葡萄糖消耗速率在24 h后比SaPLD組慢，48 h后和野生型的糖消耗量基本一致，這也是SaPLDNaCl組的生物量在120 h前一直低于SaPLD組的原因，可能是滲透壓的變化導(dǎo)致菌株細(xì)胞代謝發(fā)生了調(diào)整。72 h后SaPLD-NaCl組的糖消耗速率加快，在120 h時(shí)與其他2 組一樣糖基本消耗完，SaPLD-NaCl組的生物量最終與野生型菌株一致。由圖8C可知，野生型菌株的產(chǎn)油能力在72 h后基本趨于穩(wěn)定，而SaPLD過表達(dá)菌株產(chǎn)油能力在96 h后高于野生株。由圖8D可知，SaPLD過表達(dá)菌株的非油干基質(zhì)量濃度在72 h后低于野生型菌株。綜上，過表達(dá)細(xì)胞中更多代謝物用于油脂的合成，提高了單位細(xì)胞油脂的生產(chǎn)能力，且SaPLD-NaCl組的產(chǎn)油能力優(yōu)于SaPLD組，這可能是由于鹽脅迫改變了細(xì)胞膜的狀態(tài)，促進(jìn)了細(xì)胞的整體生長代謝，進(jìn)而提高了油脂合成。

由圖9可知，在鹽脅迫下過表達(dá)菌株的細(xì)胞皺縮破裂現(xiàn)象有了明顯緩解，細(xì)胞表面恢復(fù)光滑，形態(tài)飽滿，細(xì)胞形狀比未脅迫的SaPLD過表達(dá)菌株細(xì)胞更完整，尺寸也有所增加，基本和野生型形態(tài)一致。這表明NaCl脅迫培養(yǎng)可以改善SaPLD對細(xì)胞膜的毒害作用。從離子穩(wěn)態(tài)的角度來看，鹽脅迫下細(xì)胞需要重新平衡胞內(nèi)離子濃度以維持正常生理功能。在植物研究中，已有諸多證據(jù)表明PLD參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控過程。例如Zhang Ying等研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)PePLDδ的擬南芥通過增加編碼質(zhì)膜Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AtSOS1）和H+-ATPase（AtAHA2）基因的轉(zhuǎn)錄，使得轉(zhuǎn)基因植物能夠更好地進(jìn)行Na+外排并減少K+損失，維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)。并且，在鹽處理?xiàng)l件下抗氧化酶被激活，編碼超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶和過氧化物酶的基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，從而降低了電解質(zhì)泄漏量、丙二醛含量和H2O2水平，減輕氧化損傷。類似地，在裂殖壺菌中，鹽脅迫可能激活PLD相關(guān)的離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控通路。當(dāng)環(huán)境中的鹽濃度升高，裂殖壺菌可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上離子通道或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性與表達(dá)，促進(jìn)Na+排出細(xì)胞，減少胞內(nèi)Na+積累對細(xì)胞造成的毒性影響，同時(shí)維持K+等其他離子的正常濃度梯度，保障細(xì)胞內(nèi)酶活性和代謝反應(yīng)的正常進(jìn)行。不僅如此，鹽脅迫促使PLD參與激活抗氧化酶促系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶等。這些酶能夠協(xié)同作用，將細(xì)胞內(nèi)過多產(chǎn)生的活性氧，如超氧陰離子自由基、過氧化氫等轉(zhuǎn)化為無害的水和氧氣，降低活性氧對細(xì)胞大分子物質(zhì)，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷，進(jìn)而緩解PLD過表達(dá)可能帶來的細(xì)胞毒性。

綜上所述，鹽脅迫緩解PLD對裂殖壺菌細(xì)胞毒性的機(jī)制是多方面的，涉及離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、抗氧化防御系統(tǒng)激活等。未來研究可借助轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)，深入分析鹽脅迫下裂殖壺菌細(xì)胞內(nèi)的分子變化，進(jìn)一步明確這些機(jī)制之間的相互關(guān)系與協(xié)同作用，為更好地理解和利用裂殖壺菌的生理特性提供理論依據(jù)。

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SAPLD過表達(dá)對二十碳五烯酸（EPA）和DHA合成的影響

由圖10可知，改造菌中EPA的合成較野生型均有明顯增加，且NaCl脅迫培養(yǎng)后，EPA的合成進(jìn)一步提高。DHA合成呈現(xiàn)出相反的變化，突變株中DHA的產(chǎn)量和單位細(xì)胞內(nèi)的含量均比野生型低，但脅迫培養(yǎng)的突變株還是略高于未脅迫培養(yǎng)的突變株。雖然EPA和DHA均是PUFAs，但卻出現(xiàn)了不同的變化，這可能是兩者的合成途徑不同，需要進(jìn)一步的分析研究。

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SaPLD過表達(dá)對總油脂中脂肪酸組成的影響

如表1所示，在搖瓶發(fā)酵過程中SaPLD過表達(dá)對脂肪酸組成成分產(chǎn)生了明顯影響，其中SFAs相對含量提高（主要體現(xiàn)在C16:0的增加），PUFAs相對含量下降。與野生型菌株相比，在144 h時(shí)突變菌株的SFAs相對含量極顯著提高（P＜0.01），PUFAs和DHA相對含量均極顯著降低（P＜0.01），這說明SaPLD過表達(dá)不利于PUFAs的積累，尤其是DHA的合成。PUFAs的減少會(huì)對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利的影響，從而影響裂殖壺菌對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，進(jìn)而影響了細(xì)胞生長。但EPA呈現(xiàn)了相反的變化，SaPLD過表達(dá)增加了脂肪酸中EPA的占比，在144 h時(shí)EPA占比比野生型菌株提高了35.7%，圖10也顯示SaPLD過表達(dá)菌株的EPA產(chǎn)量和單位細(xì)胞內(nèi)含量分別比野生型提高了約43%和約70%，進(jìn)一步說明SaPLD過表達(dá)有利于EPA的合成。

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SaPLD過表達(dá)對磷脂代謝的影響

7.1 SaPLD過表達(dá)對磷脂合成的影響

如圖11所示，SaPLD過表達(dá)后使得細(xì)胞磷脂整體合成減弱，TAG合成增強(qiáng)。3 株菌中TAG的相對含量在脂質(zhì)轉(zhuǎn)化期（120 h）均比脂質(zhì)合成期（72 h）高，而磷脂相對含量則降低，表明裂殖壺菌在后期會(huì)將磷脂轉(zhuǎn)化為TAG，從而提高TAG的產(chǎn)量。此外，在鹽脅迫條件下突變株的磷脂通路在前期（72 h）會(huì)比未脅迫時(shí)略有恢復(fù)，這說明鹽脅迫可能通過調(diào)控磷脂代謝改變細(xì)胞膜狀態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長。

7.2 SaPLD過表達(dá)對磷脂中脂肪酸組成的影響

由表2可知，無論是在野生型還是過表達(dá)菌株中，TAG中SFAs含量最高，接近50%～60%，其中C16:0占比最高，接近SFAs的90%以上；大部分的DHA、DPA和EPA占總PUFAs含量的90%以上，表明PUFAs主要貯存在TAG中；從發(fā)酵時(shí)間來看，所有菌株在發(fā)酵后期的TAG中EPA和DHA含量均有增加，相應(yīng)地SFAs出現(xiàn)了下降，表明發(fā)酵后期更多的PUFAs遷移積累在TAG中；從不同菌株來看，SaPLD過表達(dá)明顯降低了發(fā)酵過程TAG中的DHA含量，相對地提高了SFAs含量和EPA含量，這說明SaPLD過表達(dá)抑制了TAG中DHA的結(jié)合，促進(jìn)了SFAs和EPA的結(jié)合，也表明EPA和DHA的合成途徑存在差異，EPA可能更多地與SFAs的合成途徑有關(guān)。

磷脂中SFAs含量也接近40%～50%，但其中C 16:0 占比低于TAG，而C 18:0 占比明顯提高，說明C 18:0 更偏向結(jié)合在磷脂中；磷脂中結(jié)合的其他脂肪酸接近30%～40%，而PUFAs僅占10%～15%，其中基本不含EPA，說明PUFAs主要結(jié)合在TAG中；從發(fā)酵時(shí)間來看，在120 h時(shí)所有菌株磷脂中DHA含量均低于72 h時(shí)，結(jié)合TAG中后期DHA含量的增加，推測后期DHA從磷脂向TAG中遷移貯存；而過表達(dá)菌株磷脂中SFAs含量和其他脂肪酸則呈現(xiàn)與野生型菌株不同的變化，后期磷脂中SFAs含量略微增加，PUFAs含量只有略微降低，表明SaPLD的過表達(dá)抑制了PUFAs從磷脂向TAG中的遷移，最終減少了DHA的積累；從不同菌株來看，對比野生型，過表達(dá)SaPLD在72 h時(shí)同時(shí)降低了磷脂中SFAs和DHA的占比，而在120 h同時(shí)提高了二者的占比，但前期對DHA的影響更為明顯，后期對SFAs的影響更為明顯，這說明SaPLD表達(dá)在前期抑制了磷脂結(jié)合脂肪酸的能力，主要抑制DHA的結(jié)合能力，在后期有利于脂肪酸結(jié)合到磷脂上，主要促進(jìn)SFAs的結(jié)合。

另外，相比于未脅迫培養(yǎng)，鹽脅迫培養(yǎng)并未對突變株中各脂肪酸含量有明顯影響，進(jìn)一步說明鹽脅迫對脂肪酸的主要合成途徑并未產(chǎn)生影響，主要是保護(hù)了細(xì)胞膜的形態(tài)，進(jìn)而促進(jìn)了細(xì)胞生長。值得注意的是，EPA主要結(jié)合在TAG中，在磷脂中只檢測到了極其微量的EPA，表明EPA的積累更多地與TAG合成通路有關(guān)，與磷脂代謝相關(guān)性不大，這為開展裂殖壺菌產(chǎn)EPA的研究提供了新的視角。

7.3 SaPLD過表達(dá)對磷脂類型的影響

如圖12所示，裂殖壺菌中磷脂種類豐富，野生型菌株與SaPLD過表達(dá)菌株中都檢測出PC、PG、PI、PE、LPC、PS和PA這7大類磷脂，占比最高的主要為PC、PG和PI，其中PC含量占磷脂總量的一半左右。Wang Guang等也發(fā)現(xiàn)在裂殖壺菌中PC是主要的極性脂質(zhì)。此外，菌株磷脂種類占比在發(fā)酵的不同時(shí)期均出現(xiàn)了變化，表明在對數(shù)生長期（72 h）和脂質(zhì)轉(zhuǎn)化期（120 h）磷脂的代謝會(huì)發(fā)生變化。

對于野生菌株而言，除了PG在120 h時(shí)明顯降低之外，其他磷脂均有不同程度的增加。PG與細(xì)胞的生長狀況有著密切的聯(lián)系，在對數(shù)生長期發(fā)酵液中碳源充足，且葡萄糖轉(zhuǎn)換為甘油比轉(zhuǎn)化為其他磷脂極性頭部基團(tuán)要容易的多，所以在碳源充足的情況下合成PG可能更容易滿足細(xì)胞指數(shù)生產(chǎn)期間的膜磷脂供應(yīng)；在脂質(zhì)轉(zhuǎn)化期，葡萄糖消耗殆盡，細(xì)胞停止增殖，膜磷脂代謝從磷脂合成轉(zhuǎn)向磷脂間的相互轉(zhuǎn)化，PG合成降低，這又會(huì)影響細(xì)胞應(yīng)激感應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制的脂質(zhì)依賴性。PI占比的增加可能是因?yàn)榧?xì)胞中脂質(zhì)代謝活躍，PI作為信號分子加強(qiáng)了相關(guān)代謝的調(diào)控。LPC占比的增加可能是因?yàn)榧?xì)胞生長后期開始破裂，導(dǎo)致LPC的增加，這與Moog等發(fā)現(xiàn)LPC含量的增加會(huì)使細(xì)胞膜發(fā)生破裂，影響細(xì)胞生長的結(jié)果一致。該研究表明PE、PS和PA占比雖然很少，但它們組成的變化在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能中也發(fā)揮著重要作用。

對比野生型和過表達(dá)菌株的磷脂組成，在72 h時(shí)過表達(dá)菌株中PG和PC含量明顯降低，而PI、LPC和PA均有一定程度的增加，PS和PE無明顯變化。PLD能夠催化水解反應(yīng)和轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)，一方面SaPLD的過表達(dá)催化底物PC和PG發(fā)生水解反應(yīng)，使二者含量降低，導(dǎo)致過表達(dá)菌株細(xì)胞生長開始低于野生型，而PC和PG的水解使得產(chǎn)物PA含量增加，PA經(jīng)Kennedy途徑合成TAG，這也是SaPLD過表達(dá)菌株油脂產(chǎn)量增加的原因之一；另一方面PLD的轉(zhuǎn)磷脂?；钚允沟貌煌字g發(fā)生了轉(zhuǎn)換，PG轉(zhuǎn)化為信號作用更強(qiáng)的PI進(jìn)行信號傳導(dǎo)和脂質(zhì)調(diào)控。在發(fā)酵120 h時(shí)，過表達(dá)菌株中LPC和PA占比明顯提高。LPC的增加可能是因?yàn)镾aPLD過表達(dá)對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性，從而使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。PA的增加進(jìn)一步說明有更多的磷脂發(fā)生水解，進(jìn)而對應(yīng)于PI和PG含量減少，從而增強(qiáng)了Kennedy途徑代謝流，促進(jìn)磷脂向TAG的轉(zhuǎn)變。

對于過表達(dá)菌株而言，鹽脅迫培養(yǎng)沒有明顯改變相同時(shí)間段下細(xì)胞的磷脂組成，這表明鹽脅迫抵抗PLD的細(xì)胞毒性并非通過改變磷脂成分，而有可能是改變了胞內(nèi)外的離子代謝流，從而調(diào)控了細(xì)胞膜功能，維護(hù)了細(xì)胞形態(tài)的完整性，這與2.7.2節(jié)的結(jié)論相印證。

7.4 SaPLD過表達(dá)對相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

脂肪酸合成的第1步是通過乙酰輔酶A羧化酶（ACC）將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，為脂肪酸和油脂積累提供前體物。如圖13A所示，SaPLD的過表達(dá)使ACC轉(zhuǎn)錄水平在前期提高，而在發(fā)酵的中后期降低，結(jié)合圖5A可知SaPLD過表達(dá)后使菌株在前期把更多的葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)合成前體丙二酰輔酶A，從而促進(jìn)中后期油脂的合成。Li Jing等發(fā)現(xiàn)在氮缺陷條件下Nannochloropsis中ACC的表達(dá)后期降低，但總脂質(zhì)含量顯著增加。鏈長因子（CLF）作為PKS基因簇上的延長因子，調(diào)控著超長鏈PUFAs的合成，現(xiàn)已證實(shí)PKS和FAS途徑分別負(fù)責(zé)裂殖壺菌中DHA和SFAs的合成，故對脂肪酸合成途徑相關(guān)的FAS和CLF進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平分析。如圖13B、C所示，SaPLD的過表達(dá)使菌株細(xì)胞中FAS基因轉(zhuǎn)錄水平上升，而CLF基因轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了下調(diào)，這與油脂中脂肪酸占比變化相印證（表1），SFAs含量增加，而DHA占比減少。磷脂酸磷酸酶（PAP）催化PA合成DAG，再由DGAT催化合成TAG。如圖13D、E所示，過表達(dá)菌株中PAP和DGAT的轉(zhuǎn)錄水平均高于野生型，這說明SaPLD過表達(dá)使裂殖壺菌中Kennedy途徑增強(qiáng)，產(chǎn)生更多的PA（圖12）和DAG去合成TAG，最終提高油脂產(chǎn)量（圖5）。PDAT和PDCT兩種酶均可作用于PC將其分別轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)為TAG和DAG。Lu Chaofu等在擬南芥突變種子中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PDCT突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致DAG中的PUFAs含量顯著降低。由圖13F、G可知，在裂殖壺菌中過表達(dá)SaPLD使PDAT的轉(zhuǎn)錄水平降低，而PDCT的表達(dá)水平先增加后降低，這表明SaPLD的過表達(dá)削弱了PC通過PDAT催化直接將脂?；D(zhuǎn)移至DAG形成TAG的通路，相應(yīng)強(qiáng)化了水解其他磷脂生成PA和將PC經(jīng)PDCT作用轉(zhuǎn)化為DAG的通路，DAG再經(jīng)DGAT催化合成TAG，最終使得TAG含量增加。

7.5 SaPLD過表達(dá)調(diào)控裂殖壺菌油脂代謝的機(jī)制分析

SaPLD過表達(dá)后使裂殖壺菌細(xì)胞生長和油脂代謝都發(fā)生了變化，其對脂質(zhì)代謝的調(diào)控機(jī)制如圖14所示。過表達(dá)的SaPLD更多地發(fā)揮水解作用，使得總磷脂含量降低，其中主要催化磷脂PC發(fā)生水解反應(yīng)，使PC轉(zhuǎn)化為PA，促進(jìn)了PA經(jīng)Kennedy途徑形成DAG進(jìn)而轉(zhuǎn)化為TAG，最終使總油含量提高。由于PC的水解，使得主要通過結(jié)合PC再轉(zhuǎn)移至TAG的DHA減少，游離的DHA會(huì)反饋抑制合成PUFAs的PKS通路，相應(yīng)促進(jìn)了合成SFAs的FAS通路，最終使得與PKS通路相關(guān)的DHA合成降低，與FAS通路相關(guān)的EPA合成增加。Liu Jin等在利用微擬球藻提升EPA產(chǎn)量的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)的代謝流會(huì)發(fā)生改變，使得參與SFAs合成的相關(guān)物質(zhì)和能量供應(yīng)也相應(yīng)增加，以滿足整體脂肪酸合成網(wǎng)絡(luò)的需求，體現(xiàn)出EPA合成與SFAs合成之間存在正向關(guān)聯(lián)。對脂肪酸合成途徑的干預(yù)并非孤立地影響某一種脂肪酸的合成，而是對整個(gè)脂肪酸代謝網(wǎng)絡(luò)產(chǎn)生系統(tǒng)性影響。這進(jìn)一步支持了本研究的結(jié)論，即SaPLD過表達(dá)引發(fā)的代謝變化并非單一途徑的改變，而是涉及多個(gè)脂肪酸合成途徑之間的相互作用。當(dāng)PKS通路受游離DHA反饋抑制而影響DHA合成時(shí)，與之相關(guān)聯(lián)的FAS通路被促進(jìn)，使得EPA合成增加的同時(shí)，SFAs合成途徑也可能因整體代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)整而受到正向影響，最終表現(xiàn)出EPA與SFAs合成途徑呈正相關(guān)。

8

結(jié) 論

本研究通過對裂殖壺菌中異源過表達(dá)SaPLD的深入探究，系統(tǒng)揭示了PLD在調(diào)控細(xì)胞生長與油脂代謝過程中的復(fù)雜機(jī)制。SaPLD通過水解PC和PG，增強(qiáng)PA生成，激活Kennedy途徑，最終實(shí)現(xiàn)油脂合成的上調(diào)。盡管SaPLD過表達(dá)對細(xì)胞生長具有一定毒性，但通過鹽脅迫手段可有效緩解其負(fù)面影響，并進(jìn)一步提升油脂產(chǎn)量。在脂肪酸代謝方面，SaPLD的引入改變了裂殖壺菌脂肪酸合成偏好，在降低DHA合成的同時(shí)，大幅促進(jìn)了EPA的積累，這為裂殖壺菌作為EPA生產(chǎn)平臺(tái)的開發(fā)提供了新方向。本研究不僅深化了對裂殖壺菌磷脂代謝與油脂合成調(diào)控機(jī)制的理解，更為工業(yè)菌株改造提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)策略。未來研究可在此基礎(chǔ)上，深入解析SaPLD水解活性調(diào)控的分子機(jī)制，通過蛋白質(zhì)工程手段對SaPLD進(jìn)行定向改造，增強(qiáng)其在裂殖壺菌中的催化特異性與穩(wěn)定性，減少對細(xì)胞生長的負(fù)面影響，為實(shí)現(xiàn)裂殖壺菌高效合成特定脂肪酸、滿足食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的需求奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

作者簡介

第一作者：

童俊，廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院2024級碩士研究生，研究方向主要為功能油脂的微生物合成。

通信作者：

凌雪萍，廈門大學(xué)化工學(xué)院副教授，博士，研究領(lǐng)域：微生物代謝工程、酶工程與益生菌發(fā)酵工藝開發(fā)；先后主持和參與國家級、省部級等項(xiàng)目20余項(xiàng)，企業(yè)合作與開發(fā)項(xiàng)目15余項(xiàng)；發(fā)表國內(nèi)外學(xué)術(shù)論文50余篇，獲得國內(nèi)外授權(quán)專利20余項(xiàng)。在微生物合成多不飽和脂肪酸領(lǐng)域研究多年，完成了從菌種進(jìn)化改造、合成培養(yǎng)基及流加培養(yǎng)工藝優(yōu)化、小試、中試到工業(yè)化生產(chǎn)的成套發(fā)酵和油脂提取、精制、包埋等集成化技術(shù)和工藝。其中DHA生產(chǎn)主要技術(shù)指標(biāo)遠(yuǎn)超同類行業(yè)水平，已在廈門匯盛生物有限公司、廈門金達(dá)威集團(tuán)等多家企業(yè)實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，促進(jìn)了相關(guān)行業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展與產(chǎn)業(yè)布局。

引文格式：

童俊, 陸濤, 盧英華, 等. 異源表達(dá)磷脂酶D調(diào)控裂殖壺菌磷脂代謝對脂質(zhì)合成的影響[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(22): 213-226. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250508-034.

TONG Jun, LU Tao, LU Yinghua, et al. Effect of heterologous expression of phospholipase D on lipid synthesis by regulating phospholipid metabolism in Schizochytrium sp.[J]. Food Science, 2025, 46(22): 213-226. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250508-034.

實(shí)習(xí)編輯：楊倩；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

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