RIPK3 是程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)控分子。其經(jīng)典激活途徑依賴于 RHIM 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的寡聚化與自磷酸化，進(jìn)而激活 MLKL 以誘導(dǎo)程序性壞死。當(dāng)激酶活性受到抑制時(shí)， RIPK3 則通過 RIPK1-FADD-Caspase-8 軸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡?；诖耍瑐鹘y(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為 RIPK3 的激酶活性決定了下游信號(hào)的轉(zhuǎn)換方向。然而，攜帶激酶失活突變（如 K51A ）的小鼠能夠正常存活，且使用低劑量抑制劑完全阻斷程序性壞死也并不能有效誘導(dǎo)凋亡。這些現(xiàn)象表明， RIPK3 信號(hào)輸出的調(diào)控機(jī)制比以往認(rèn)知更為復(fù)雜。目前， RIPK3 如何決定下游信號(hào)輸出的具體分子機(jī)制仍不明確。

此外， 泛死亡 （ PANoptosis ） 是近年來提出的一種新型細(xì)胞死亡方式，整合了程序性壞死、凋亡與焦亡的特征。盡管已有多種受體被報(bào)道可誘導(dǎo) PANoptosis ，但相關(guān)證據(jù)多依賴于反映細(xì)胞群體平均信號(hào)的免疫印跡實(shí)驗(yàn)，缺乏對(duì)下游分子機(jī)制的深入解析，也尚未明確 PANoptosis 與其他三種經(jīng)典細(xì)胞死亡方式在分子及細(xì)胞水平上的特征差異。因此， PANoptosis 自提出以來一直飽受爭議。

近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院鐘華教授 和楊宇博士 團(tuán)隊(duì)在Cell Death and Differentiation發(fā)表題為 RIPK3 Sequentially Recruits MLKL and RIPK1 to Induce PANoptosis and Chemokine Production 的研究論文，發(fā)現(xiàn)RIPK3直接激活可在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)觸發(fā)程序性壞死、凋亡與焦亡通路，且三條通路之間存在復(fù)雜的交叉調(diào)控，為PANoptosis的發(fā)生提供了直接證據(jù)。同時(shí)，研究揭示了RIPK3以聚合狀態(tài)依賴的方式依次招募MLKL與RIPK1并形成以RIPK3為核心的死亡復(fù)合物的分子機(jī)制。

主要研究發(fā)現(xiàn)：

1 、 RIPK3 直接激活誘導(dǎo)同一細(xì)胞內(nèi) MLKL 磷酸化與 caspase 切割共發(fā)生

通過三種獨(dú)立實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（高滲應(yīng)激、 RIPK3 化學(xué)二聚化、 Dox 誘導(dǎo)過表達(dá)）及多種細(xì)胞類型，免疫印跡均檢測到 p-MLKL 與 cleaved caspase-8 、 -3/-7 共發(fā)生。細(xì)胞死亡 僅被凋亡與壞死抑制劑聯(lián)合處理完全抑制。免疫熒光證實(shí) p-MLKL 與 cleaved caspase 信號(hào)在單細(xì)胞內(nèi)共定位。這些事件嚴(yán)格依賴 RIPK3 ：僅見于異位表達(dá) RIPK3 的細(xì)胞，在 RIPK3 敲除的內(nèi)源表達(dá)細(xì)胞中缺失。表明 RIPK3 激活可在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)雙重信號(hào)輸出。

2 、 MLKL 與 RIPK1 因?qū)?RIPK3 寡聚態(tài)和多聚態(tài)的親和力差異而被順序招募

免疫共沉淀和時(shí)間分辨實(shí)驗(yàn)顯示， MLKL 先于 RIPK1 被招募至 RIPK3 ?；罴?xì)胞成像與免疫熒光表明， RIPK3 二聚化后形成不斷增長的聚合物。分子排阻色譜揭示： MLKL 快速結(jié)合低階 RIPK3 寡聚體，而 RIPK1 僅結(jié)合高度多聚化的 RIPK3 。在 RIPK3 主要為寡聚態(tài)的早期， MLKL 與之強(qiáng)共定位而 RIPK1 很少；進(jìn)入高度多聚化階段后， RIPK1 結(jié)合顯著增加， MLKL 共定位減少并形成不依賴 RIPK3 的同聚物。據(jù)此提出“ Differential-Affinity Stepwise Assembly ”模型。與經(jīng)典壞死小體相比，該復(fù)合物中 RIPK1 摻入水平更低，且在形態(tài)、大小、空間組織、組裝順序及蛋白化學(xué)計(jì)量上均不同。

3 、 RIPK3 啟動(dòng)的 PANoptosis 源于細(xì)胞死亡通路間的整合性信號(hào)網(wǎng)絡(luò)與持續(xù)串?dāng)_

盡管 RIPK3 激酶活性對(duì) MLKL 磷酸化至關(guān)重要，但抑制或損傷其活性卻能增強(qiáng) RIPK1 和 caspase-8 向 RIPK3 的招募，進(jìn)而增加 caspase-3 和 GSDMD 的切割。另一方面， caspase-3 通過切割 RIPK3 負(fù)向調(diào)控 MLKL 磷酸化；阻斷 caspase 活性或敲除 caspase-3 、 caspase-8 、 RIPK1 可消除 RIPK3 切割，并升高 RIPK3 和 MLKL 的磷酸化水平。此外， caspase-3 在 D88 位點(diǎn)切割 GSDMD ，使 p30 片段失活，抑制 GSDMD 介導(dǎo)的膜破裂。這些結(jié)果表明，各細(xì)胞死亡通路并非獨(dú)立運(yùn)行，而是通過廣泛串?dāng)_維持動(dòng)態(tài)整合的信號(hào)系統(tǒng)。

4 、 RIPK3 驅(qū)動(dòng)的 PANoptosis 具有獨(dú)特形態(tài)學(xué)與 DAMPs 釋放譜

在同一細(xì)胞系統(tǒng)中，通過相差和熒光顯微鏡比較不同死亡方式的形態(tài)進(jìn)程，劃分出 PANoptosis 的五個(gè)階段，其形態(tài)特征構(gòu)成獨(dú)特譜系，無法單純歸為壞死性凋亡、凋亡或焦亡。透射電鏡顯示，線粒體與核膜等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)損傷動(dòng)力學(xué)不同于凋亡和壞死性凋亡。這種獨(dú)特動(dòng)力學(xué)源于同一細(xì)胞內(nèi) MLKL 磷酸化與 caspase 切割的共發(fā)生，從而解釋了線粒體與核 DAMPs 釋放增強(qiáng)的現(xiàn)象。

5 、 RIPK3 啟動(dòng)的 PANoptosis 呈現(xiàn)獨(dú)特的趨化因子釋放譜

通過 RNA-seq 、 Luminex 及 qRT -PCR 在小鼠和人類細(xì)胞中驗(yàn)證， PANoptosis 以 CXCL1 、 CXCL10 、 CCL2 、 CCL20 上調(diào)為特征。機(jī)制上， CXCL1 、 CCL2 、 CCL20 由 MLKL 和 RIPK1 共同介導(dǎo)，其中 RIPK1 主導(dǎo)； CXCL10 則完全依賴 RIPK3 – MLKL 軸，但被 RIPK1 強(qiáng)烈抑制。激酶抑制實(shí)驗(yàn)表明， MLKL 介導(dǎo)的趨化因子上調(diào)依賴 RIPK3 激酶活性，而 RIPK1 介導(dǎo)的效應(yīng)不依賴其激酶活性。結(jié)合 RNA-seq 與化合物篩選，鑒定出 IKK – NF- κ B 軸為 RIPK 依賴的趨化因子產(chǎn)生通路。綜上，該趨化因子釋放譜不同于任何先前報(bào)道的模式。

綜上，本研究 揭示了 RIPK3 以聚合狀態(tài)依賴的方式順序招募 MLKL 與 RIPK1 ，組裝形成 RIPK3-MLKL-RIPK1-FADD-Caspase-8 死亡復(fù)合物，從而在同一細(xì)胞內(nèi)同步啟動(dòng)程序性壞死、凋亡與焦亡。同時(shí)，闡明了 RIPK3 、 Caspase-8/3 與 GSDMD 之間的交叉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以及 RIPK1 通過非激酶依賴的 NF- κ B 途徑主導(dǎo)趨化因子產(chǎn)生的機(jī)制 。該工作為 PANoptosis 的發(fā)生提供了直接證據(jù)，確立了 RIPK3 作為整合多種程序性細(xì)胞死亡的分子平臺(tái)的地位，并為靶向炎癥性細(xì)胞死亡的治療策略提供了新的理論框架。

RIPK3 啟動(dòng)泛死亡的機(jī)制模型

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院楊宇博士（ 兼 共同通訊作者）、王悅博士、武二鵬博士，以及復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王洋青年副研究員為本文的共同第一作者。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院鐘華教授、鐘潤波副教授和周嚴(yán)醫(yī)師為本文的共同通訊作者。本研究得到了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬胸科醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室、中國科學(xué)院上海分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心化學(xué)生物學(xué) / 細(xì)胞分析技術(shù)平臺(tái)的大力支持。

https://www.nature.com/articles/s41418-026-01737-2

制版人：十一

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