眾多遺傳疾病源于基因序列的特定突變，理論上可通過向致病基因中插入正常功能拷貝來實現(xiàn)“一勞永逸”的修復。然而，現(xiàn)有的基因插入工具面臨嚴峻挑戰(zhàn)：依賴DNA雙鏈斷裂的修復途徑效率低下且易產生非預期突變；而基于整合酶或轉座酶的策略則需要額外蛋白組分，遞送復雜且插入效率隨片段增長急劇下降。如何在不需要雙鏈斷裂和外源酶的條件下，實現(xiàn)大片段DNA的高效、精準、可編程插入，是該領域長期懸而未決的難題。

2026年4月22日，武漢大學醫(yī)學研究院、免疫與代謝前沿科學中心張楹教授與殷昊教授團隊在《自然》（Nature）雜志在線發(fā)表了題為“Quadruple pegRNA enables programmable and efficient large genomic insertion”的研究論文。該研究首次報道了一種名為QuadPE（四重引導編輯）的新型基因插入系統(tǒng)，利用四個經工程化設計的引導RNA（pegRNA）協(xié)同作用，在不依賴DNA雙鏈斷裂、整合酶或轉座酶的情況下，實現(xiàn)了長達26 kb外源DNA片段的高效、精準、可編程插入。

研究團隊從先前基于成對pegRNA的插入工作出發(fā)，提出一個創(chuàng)新構想：用一對pegRNA在基因組靶點產生3'單鏈懸垂（flap），另一對pegRNA同時在供體DNA上生成互補懸垂，二者通過序列互補退火，引導供體DNA定向整合至基因組。他們系統(tǒng)篩選了24種基因組-供體組合方式，發(fā)現(xiàn)采用“PAM-out”構型（切割位點朝外）的基因組靶向pegRNA與采用環(huán)形供體、帶有互補懸垂設計的cV6組合效率最優(yōu)，命名為QuadPE。

進一步優(yōu)化表明：30個核苷酸長度、約50% GC含量的懸垂設計最為高效；將四個pegRNA表達元件兩兩合并于兩個載體上，與四個獨立載體效率相當。利用優(yōu)化后的QuadPE，研究團隊在HEK293T、K562等6種細胞系的14個基因組位點上，成功插入了1.6 kb至26 kb不等的DNA片段。對于9.5 kb的插入，效率最高可達約60%。與當前先進的整合酶介導系統(tǒng)（eePASSIGE）和轉座酶介導系統(tǒng)（evoCAST）相比，QuadPE對9.5 kb片段的插入效率分別提高了11倍和12倍。

尤為重要的是，QuadPE在非分裂細胞中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。細胞周期阻滯實驗表明，當兩個基因組靶向pegRNA的間距控制在20–112 bp時，QuadPE介導的插入效率不受G1期或G1/S期阻滯影響。在原代小鼠神經元（已退出細胞周期的有絲分裂后細胞）中，QuadPE實現(xiàn)了約4.6 kb片段最高12.5%的插入效率。在激活的人原代T細胞中，通過化學修飾的pegRNA與mRNA遞送，QuadPE在TRAC位點達到了51%的插入效率。全基因組脫靶檢測和Digenome-seq分析證實，QuadPE的脫靶插入事件及非特異性切割均極低，展現(xiàn)出高特異性。

該研究還通過恢復GFP報告基因功能驗證了QuadPE的實用性：在K562細胞中，攜帶CMV啟動子-EGFP的9.5 kb環(huán)形供體經QuadPE整合后，24天后仍可檢測到約33%的GFP陽性細胞；采用無啟動子、依賴內源AAVS1啟動子的剪接受體-GFP策略，PAM-out構型同樣獲得約15%的GFP陽性率。

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