研究團隊：中山大學張超教授團隊

發(fā)表刊物：Bioact. Mater.（IF=20.3）

發(fā)表時間：2025.8.25

文章標題：包封MSC-Exos和ZIF-8的水凝膠支架通過協(xié)調成骨和免疫調節(jié)促進骨再生

英文原題：Hydrogel scaffold encapsulating MSC-Exos and ZIF-8 promotes bone regeneration via coordinating osteogenesis and immunomodulation

關鍵詞：MSC-Exos ZIF-8 水凝膠 成骨 免疫調節(jié)

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2025.08.026

研究摘要

大尺寸骨缺損的修復是骨科與再生醫(yī)學領域當下所面臨的重大臨床挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療方法存在供體有限、免疫排斥和二次手術創(chuàng)傷等問題。近年來，基于間充質干細胞外泌體（MSC-Exos）的骨組織工程策略顯示出良好的成骨潛力，但其免疫調節(jié)功能在成骨誘導過程中顯著下降，限制了其在炎癥微環(huán)境中的修復效果。

中山大學張超教授團隊開發(fā)了一種新型復合水凝膠支架，將成骨誘導的MSC-Exos與金屬有機框架材料ZIF-8共同封裝于甲基丙烯酰化明膠（GelMA）中，以實現(xiàn)成骨與免疫調節(jié)的雙重協(xié)同作用。該系統(tǒng)通過持續(xù)釋放鋅離子與外泌體中的活性成分（如miR-23a-3p），一方面激活BMSCs中PTEN/AKT信號通路促進成骨分化，另一方面通過抑制巨噬細胞內NF-κB通路調控其向M2抗炎表型極化。研究在大鼠顱骨缺損模型中驗證了該支架可顯著加速骨再生并緩解局部炎癥反應，為骨缺損的免疫微環(huán)境調控治療提供了新思路。

方案1.用于骨缺損協(xié)同治療的復合水凝膠支架的示意圖

主要研究內容

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復合水凝膠的制備與表征

圖1.ZIF-8納米顆粒的制造和MSC-Exos的分離

圖2. ZIF-8納米顆粒的表征

圖3. MSC-Exos和ZIF-8包封的GelMA水凝膠的表征

研究采用一鍋法在甲醇中通過Zn2?與2-甲基咪唑配位自組裝合成ZIF-8納米顆粒，呈現(xiàn)典型的菱形十二面體結構，平均粒徑約400 nm，Zn、C、N、O元素均勻分布（圖1(C)）。通過超速離心從經14天成骨誘導的BMSCs上清液中提取MSC-Exos，透射電鏡顯示其為球形或橢球形囊泡，粒徑分布40–200 nm，平均157.2 nm，Western blot驗證CD63、CD9、CD81表達陽性，Calnexin為陰性（圖1(E-G)）。ZIF-8與MSC-Exos的Zeta電位分別為+14.14 mV和-12.66 mV，可通過靜電作用延緩釋放。

將二者共同封裝于甲基丙烯酰化明膠（GelMA）水凝膠中，通過405 nm光引發(fā)交聯(lián)。XRD顯示ZIF-8在凝膠中保持晶體結構（圖3(C)），F(xiàn)TIR證實Zn-N配位鍵存在（圖3(B)）。復合水凝膠（Z/E@Gel）具有高度互聯(lián)的多孔結構，孔徑40–70 μm，孔隙率約77.2%，適于細胞浸潤。ZIF-8的加入顯著提升水凝膠壓縮強度（從68.8 kPa至108.3 kPa）和模量（圖3(D)），并降低溶脹率。釋放實驗表明，Z/E@Gel中外泌體和Zn2?釋放均較緩慢，pH穩(wěn)定于8.3左右，有利于成骨微環(huán)境建立（圖3(G-I)）。

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體外生物相容性評估

圖4.復合水凝膠的生物相容性評價

通過CCK-8法和細胞形態(tài)觀察評估水凝膠的細胞相容性。發(fā)現(xiàn)與Z/E@Gel共培養(yǎng)的BMSCs、HUVECs和RAW264.7細胞均保持高活力，細胞呈多邊形并具絲狀偽足，粘附密度無顯著差異（圖4(D-E)）。且PKH67標記顯示MSC-Exos可被三類細胞有效內吞，其中巨噬細胞內吞效率最高，與其高表達清道夫受體、整合素和Toll樣受體有關（圖4(C)）。水凝膠的多孔結構（圖4(B)）為細胞遷移和營養(yǎng)擴散提供支持，孔隙率超70%有助于代謝物排泄和微環(huán)境穩(wěn)定。所有水凝膠組在第1、3、5天均促進BMSCs增殖，ZIF-8與MSC-Exos的引入進一步增強了生物活性。

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體外成骨分化與機制分析

圖5.體外水凝膠孵育的BMSCs的成骨分化

圖6. MSC-Exos誘導BMSCs成骨分化的分子機制

Z/E@Gel組ALP活性、ECM礦化及成骨標志蛋白（OCN、Col I）表達均最高，表明MSC-Exos與ZIF-8具有協(xié)同成骨效應（圖5(A-D)）。同時成骨相關基因（Runx2、OCN、Col I）表達也顯著上調（圖5(E)）。機制上，篩選發(fā)現(xiàn)成骨誘導后MSC-Exos中14種miRNA上調，其中miR-23a-3p模擬物轉染BMSCs后成骨分化增強最顯著（圖6(A-C)）。通過多數(shù)據(jù)庫預測及雙熒光素酶報告實驗驗證，miR-23a-3p直接靶向PTEN的3'UTR（圖6(D-G)）。Western blot顯示Z/E@Gel組PTEN表達下調，p-AKT和Runx2表達上調（圖6(H)）。抑制miR-23a-3p或過表達PTEN均逆轉成骨促進作用，證實miR-23a-3p通過抑制PTEN激活AKT通路，從而促進成骨分化（圖6(I-N)）。

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體外免疫調節(jié)特性評估

圖7.水凝膠的免疫調節(jié)性質的評價

圖8. ZIF-8在免疫調節(jié)中作用的分子機制

采用LPS刺激RAW264.7細胞模擬炎癥環(huán)境，流式細胞術顯示ZIF-8@Gel和Z/E@Gel組CD206? M2型巨噬細胞比例顯著升高，CCR7? M1型比例下降（圖7(A)）。免疫熒光證實CD206表達增強，iNOS和ROS水平降低（圖7(B-E)）。qPCR顯示M2標志物（CD206、Arg-1、IL-10）表達上調，M1標志物（iNOS、TNF-α、IL-6）下調（圖7(F-G)）。RNA測序與生物信息學分析表明，ZIF-8顯著富集于NF-κB通路（圖8(A-D)）。PPI網(wǎng)絡識別出P100為核心節(jié)點，Western blot和免疫熒光顯示ZIF-8抑制P100泛素化（尤其K332/K338位點），減少其降解為p52，從而抑制非經典NF-κB通路激活，降低Rel核轉位（圖8(E-L)）。這一機制是ZIF-8調控巨噬細胞極化的分子基礎。

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水凝膠的體內生物相容性評估

圖9.體內骨形成的評價

在大鼠顱骨缺損模型中植入Z/E@Gel，4周后降解率約66.4%，與骨修復時間線匹配。血清鋅離子濃度在各組間無顯著差異，表明Zn2?緩釋未引起系統(tǒng)性累積。植入后第7天，Z/E@Gel組促炎因子（TNF-α、IL-6）水平顯著低于對照組，抗炎因子IL-10升高。肝腎功能指標（ALT、AST、BUN等）均在正常范圍，主要器官H&E染色未發(fā)現(xiàn)病理異常，表明材料具有良好的體內生物安全性和降解相容性。

總結

研究成功開發(fā)了一種生物能量活性水凝膠（BAH），通過可持續(xù)釋放琥珀酸鹽調控細胞能量代謝，促進ATP合成、增強線粒體功能、減輕氧化應激，從而高效驅動軟骨細胞外基質合成。BAH具備優(yōu)良的機械性能、緩釋特性和生物相容性，在體外和體內實驗中均高效促進軟骨再生和質量修復，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)I型膠原水凝膠。該研究為關節(jié)軟骨缺損的能量代謝調控治療提供了新材料和策略，具有重要的臨床轉化潛力。