白酒是中國傳統(tǒng)蒸餾酒。因其不同的風(fēng)味口感，白酒可分為12 種香型，其中濃香型白酒在白酒銷售市場(chǎng)中占比最高，達(dá)到70%。濃香型白酒馥郁濃香、回味悠長，其呈味物質(zhì)主要來源于微生物發(fā)酵中產(chǎn)生的有機(jī)酸、酯類、高級(jí)醇以及羰基化合物。白酒中風(fēng)味物質(zhì)的形成與釀造環(huán)境中微生物群落密切相關(guān)，而酵母菌作為其中的關(guān)鍵微生物，其作用不容忽視。

庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），又稱東方伊薩酵母，在自然界分布廣泛，被廣泛應(yīng)用于白酒發(fā)酵過程。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株高產(chǎn)酯化酶P. kudriavzevii，產(chǎn)酯酶能力為33.3 U/mL。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）在混菌發(fā)酵條件下產(chǎn)酯總量達(dá)到1.932 g/L，二者具有較好的協(xié)同產(chǎn)酯能力。

近年來，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，基于串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（TMT）的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)因其通量高、誤差小、靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中廣受歡迎。

四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院的蔡嶺肸、劉春艷、鄒偉*等人以P. kudriavzevii作為研究對(duì)象，利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析其單菌發(fā)酵、與C. butyricum混菌發(fā)酵之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異。在蛋白水平上，系統(tǒng)解析單菌和混菌發(fā)酵時(shí)的生長代謝機(jī)制差異，以期為調(diào)控該混菌發(fā)酵系統(tǒng)提供一定理論參考。

1 單菌與混菌培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物分析

如圖2所示，總體上，單菌發(fā)酵所產(chǎn)生的酸、醇、酯類代謝物質(zhì)的產(chǎn)量低于混菌發(fā)酵。以乙醇為例，JM5-4單菌發(fā)酵產(chǎn)量在1.598 g/L，GD1-1單菌發(fā)酵產(chǎn)量為1.7 g/L，而混菌發(fā)酵卻達(dá)到了2.396 g/L，幾乎是JM5-4單菌發(fā)酵和GD1-1單菌發(fā)酵的1.50、1.41 倍。對(duì)于酸類物質(zhì)，JM5-4單菌發(fā)酵產(chǎn)物主要是乙酸（產(chǎn)量為0.108 g/L），而與GD1-1混菌發(fā)酵后，乙酸的產(chǎn)量顯著提升至0.425 g/L，約為JM5-4單菌發(fā)酵產(chǎn)量的4.0 倍?；炀l(fā)酵正丁酸和正己酸的產(chǎn)量分別為1.345 g/L和0.721 g/L，相較于GD1-1單菌發(fā)酵（正丁酸為1.042 g/L，己酸為0.679 g/L）分別提高了約29%和6%。JM5-4單菌發(fā)酵主要產(chǎn)乙酸乙酯（0.278 g/L），GD1-1單菌發(fā)酵為0.424 g/L，而混菌發(fā)酵乙酸乙酯產(chǎn)量為0.544 g/L，分別為單菌發(fā)酵的2.0、1.3 倍。并且在混菌發(fā)酵后，酯類物質(zhì)更為豐富，總酯產(chǎn)量更高。意外的是，JM5-4在混菌發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生了0.928 g/L的甲醇，是單菌發(fā)酵所沒有的。推測(cè)是C. butyricum GD1-1產(chǎn)生該物質(zhì)。甲醇作為GD1-1單菌發(fā)酵的產(chǎn)物時(shí)，其產(chǎn)量為1.407 g/L，明顯高于混菌發(fā)酵，約為1.5 倍。因此，可以認(rèn)為在混菌發(fā)酵條件下，對(duì)C. butyricum GD1-1甲醇的合成具有抑制作用?？傮w而言，將JM5-4與GD1-1進(jìn)行混菌發(fā)酵，促進(jìn)了代謝物產(chǎn)量，并使其代謝產(chǎn)物更加豐富。

2 蛋白質(zhì)鑒定與定量分析

如圖3A所示，二級(jí)譜圖總數(shù)為532 875 張，數(shù)據(jù)庫匹配蛋白譜圖為56 168 張；肽段總數(shù)為22 220 個(gè)，唯一肽段總數(shù)為20 777 個(gè)；鑒定到的蛋白質(zhì)總數(shù)為3 164 個(gè)，可定量蛋白有3 164 個(gè)。如圖3B所示，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.2且P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)（顯著下調(diào)的蛋白質(zhì)以藍(lán)色標(biāo)注（FC＜0.83且P＜0.05），顯著上調(diào)的蛋白質(zhì)以紅色標(biāo)注（FC＞1.2且P＜0.05），無差異的蛋白質(zhì)為灰色）篩選得到組間共有355 個(gè)差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins，DEPs），包括上調(diào)蛋白159 個(gè)、下調(diào)蛋白質(zhì)196 個(gè)。采用層次聚類算法對(duì)各組的DEPs進(jìn)行相似性分析，如圖3C所示，單菌發(fā)酵組（J）中DEPs上調(diào)與下調(diào)表達(dá)相似，混菌發(fā)酵組（JG）的DEPs表達(dá)相似；JG組內(nèi)（JG1、JG2和JG3）以JG1與JG2差異表達(dá)相似度最高，J組內(nèi)（J1、J2和J3）J1與J3差異表達(dá)相似度最高。

3 JM5-4全蛋白組學(xué)注釋與分析

基于GO與KEGG注釋，在JM5-4的單菌與混菌培養(yǎng)下，總共注釋到3 164 個(gè)蛋白質(zhì)信息，包括355 個(gè)DEPs、87 個(gè)代謝通路。

GO進(jìn)行功能注釋總共得到3 164 個(gè)蛋白、355 個(gè)DEPs，包含生物過程735 個(gè)（涉及細(xì)胞過程207 個(gè)、代謝過程207 個(gè)、生物調(diào)控67 個(gè)等），分子功能369 個(gè)（涉及催化活性160 個(gè)、結(jié)合功能148 個(gè)、結(jié)構(gòu)分子活性25 個(gè)等）和細(xì)胞組分898 個(gè)（涉及細(xì)胞199 個(gè)、細(xì)胞組分196 個(gè)、細(xì)胞器162 個(gè)、細(xì)胞器組分89 個(gè)等）。采用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)DEPs進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果如圖4所示。檸檬酸循環(huán)、藥物代謝過程、小分子代謝過程、細(xì)胞質(zhì)大核糖體亞基、細(xì)胞質(zhì)核糖體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結(jié)合、氧化還原酶活性等定位蛋白質(zhì)發(fā)生了顯著變化。利用CELLO軟件將鑒定到的DEPs進(jìn)行亞細(xì)胞定位，有257 個(gè)蛋白被定位到8 個(gè)不同的細(xì)胞器。如圖5所示，其分布于細(xì)胞質(zhì)129 個(gè)、線粒體91 個(gè)、細(xì)胞核19 個(gè)、周質(zhì)5 個(gè)、細(xì)胞膜9 個(gè)、胞外2 個(gè)和液泡、過氧化物酶體各1 個(gè)。

基于KEGG通路注釋，355 個(gè)DEPs被注釋到，結(jié)果如圖6A所示，DEPs主要集于個(gè)關(guān)鍵的代謝通路，包括氧化磷酸化、輔因子的生物合成、三羧酸循環(huán)、糖酵解/糖異生等，對(duì)JM5-4的生長與代謝具有重要影響。對(duì)DEPs進(jìn)行富集分析，結(jié)果如圖6B所示。三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化、果糖和甘露糖代謝、鏈霉素的生物合成以及新霉素、卡那霉素和慶大霉素的生物合成等重要通路發(fā)生了顯著變化。如圖6C所示，上調(diào)DEPs主要涉及通路包括三羧酸循環(huán)、乙醛酸與二羧酸代、硫辛酸代謝等，下調(diào)DEPs涉及的通路包括阿特拉津降解、細(xì)胞周期、硫胺素代謝、RNA聚合酶等。圖6D展示了DEPs在各代謝通路中的分布情況。其中丙酮酸代謝通路共注釋到7 個(gè)DEPs，氧化磷酸化通路注釋到20 個(gè)DEPs，而三羧酸循環(huán)通路則注釋到13 個(gè)DEPs。

4

P. kudriavzevii

在糖酵解/糖異生途徑中，參與代謝的4 種DEPs包括葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（EC: 5.3.1.9）、果糖-1,6-二磷酸酶（EC: 3.1.3.11）、磷酸甘油酸變位酶（EC: 5.4.2.11）和乙醇脫氫酶（EC: 1.1.1.2）均表現(xiàn)為下調(diào)。同時(shí)，己糖激酶（EC: 2.7.1.1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（EC:1.2.1.12）、丙酮酸脫氫酶（EC: 1.2.4.1）和醛脫氫酶（EC: 1.2.1.3）的DEPs則呈現(xiàn)上調(diào)狀態(tài)。在三羧酸循環(huán)中，檸檬酸合酶（EC: 2.3.3.1）、烏頭酸鹽水合酶（EC:4.2.1.3）、富馬酸水合酶（EC: 4.2.1.2）及蘋果酸脫氫酶（EC: 1.1.1.37）等相關(guān)DEPs均上調(diào)。此外，在乙醛酸及二羧酸代謝過程中，羥基丙酮酸還原酶（EC: 1.1.1.81）和乙醛酸還原酶（EC: 1.1.1.79）等DEPs也全數(shù)上調(diào)。由此可以認(rèn)為JM5-4的混菌發(fā)酵（JG組）能有效促進(jìn)碳水化合物代謝。涉及氧化磷酸化路徑的12 個(gè)DEPs，如NADH-醌氧化還原酶（EC: 7.1.1.2）、琥珀酸脫氫酶（EC:1.3.5.1）、細(xì)胞色素還原酶（EC: 7.1.1.8）、F型質(zhì)子泵ATP酶（EC: 7.1.2.2）和細(xì)胞色素氧化酶（EC: 7.1.1.9）等均上調(diào)，而細(xì)胞色素c氧化酶（COX）4、COX17、ATP酶H＋轉(zhuǎn)運(yùn)V0亞基A（ATPeV0A）和ATP酶H＋轉(zhuǎn)運(yùn)V1亞基G（ATPeV1G）等4 個(gè)DEPs則下調(diào)。這表明JM5-4的混菌發(fā)酵對(duì)能量代謝具有顯著的促進(jìn)作用。在氨基酸代謝方面，涉及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、丙氨酸-天冬氨酸代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝的多個(gè)DEPs（如羥基丙酮酸還原酶（EC: 1.1.1.81）、絲氨酸-靛醇酸轉(zhuǎn)氨酶（EC: 2.6.1.45）、絲氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（EC: 2.6.1.51）、乙酰谷氨酸激酶（EC: 2.7.2.8）、N-乙酰-γ-谷氨酰基磷酸還原酶（EC: 1.2.1.38））大部分呈現(xiàn)上調(diào)，僅少數(shù)（蘇氨酸醛縮酶（EC: 4.1.2.48）和5-氨基左旋酸合酶（EC: 2.3.1.37））為下調(diào)，表明混菌發(fā)酵能有效地促進(jìn)氨基酸代謝。再者，在脂質(zhì)代謝方面，涉及甘油脂代謝和脂肪酸降解的DEPs（例如醛脫氫酶（EC: 1.2.1.3））均呈現(xiàn)上調(diào)。酯酶（如S-甲酰谷胱甘肽水解酶（SFGH）（EC: 3.1.2.12）、核糖核酸酶（EC: 3.1.26.4）和海藻糖磷酸酶（EC: 3.1.3.12））的DEPs也均呈現(xiàn)上調(diào)，表明混菌發(fā)酵對(duì)JM5-4的部分產(chǎn)酯酶活性具有積極作用。

基于所得的注釋信息，繪制JM5-4（JG組）的代謝路徑，如圖7所示，代謝途徑相關(guān)酶如表1所示，對(duì)通路中的DEPs進(jìn)行標(biāo)記，如表2所示。在糖酵解/糖異生途徑中，相關(guān)酶上調(diào)DEPs與下調(diào)DEPs數(shù)量基本相當(dāng)，這表明該途徑所生成的丙酮酸等代謝產(chǎn)物并未受到混菌培養(yǎng)（JG組）的顯著影響。隨后，在丙酮酸脫氫酶（EC: 1.2.4.1）的催化下，丙酮酸被轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，并生成二氧化碳。同時(shí)，該酶的DEPs表現(xiàn)為上調(diào)，促進(jìn)了乙酰輔酶A的大量積累。乙酰輔酶在乙酰輔酶合成酶（EC: 6.2.1.1）的催化下轉(zhuǎn)化為更多的乙酸，又在乙酰谷氨酸激酶（EC: 1.2.1.3，DEPs上調(diào)）的催化下加速了乙醛與乙酸的合成。然而，由于乙醇脫氫酶（EC: 1.1.1.2）的DEPs下調(diào)，可能會(huì)對(duì)乙醇和乙醛的合成產(chǎn)生一定的消極影響。在檸檬酸循環(huán)中，所有相關(guān)酶的DEPs均表現(xiàn)為上調(diào)，促進(jìn)了通路中的代謝產(chǎn)物生成，進(jìn)而在碳水化合物代謝中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，參與細(xì)胞呼吸和能量生成過程，有效促進(jìn)了細(xì)胞代謝的進(jìn)行。丙酮酸在丙酮酸羧化酶（EC: 6.4.1.1）的催化下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，進(jìn)而通過2-異丙基丙二酸合成酶（EC: 2.3.3.1，DEPs上調(diào)）的催化，生成大量檸檬酸。同樣地，在相關(guān)酶（DEPs上調(diào)）的催化下，混菌培養(yǎng)（JG組）中JM5-4的代謝產(chǎn)物（如順勢(shì)烏頭酸、異檸檬酸、乙醛酸、草酰琥珀酸、戊二酸、琥珀酸、富馬酸及蘋果酸）相較于單菌培養(yǎng)（J組）均顯示出一定的提升，并伴隨CO2產(chǎn)量的增加，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量氣體。此外，JG組與J組相比，由其他酶（DEPs無明顯變化）催化生成的代謝產(chǎn)物在數(shù)量上無顯著差異。

另外，根據(jù)代謝通路，甲基草醛在D-乳酸脫水酶（EC: 4.2.1.130）的催化下能夠代謝生成D-乳酸，而乙酰輔酶A在高檸檬酸合酶（EC: 2.3.3.14）的催化下生成高檸檬酸，但這些物質(zhì)在前期實(shí)驗(yàn)中并未被檢測(cè)到。同樣，盡管在前期實(shí)驗(yàn)中能夠檢測(cè)到JM5-4代謝生成的丁二醇與16酸，但測(cè)得其在發(fā)酵液中的含量較低。因此，可以推測(cè)乳酸和高檸檬酸在發(fā)酵液中的含量過低，由于誤差存在導(dǎo)致未能被檢測(cè)出。

濃香型白酒的生產(chǎn)依賴于多種微生物的共同參與，其代謝產(chǎn)物是白酒風(fēng)味的主要來源，不同微生物之間的相互作用能顯著影響白酒的品質(zhì)。目前，混菌發(fā)酵成為白酒領(lǐng)域的熱門話題，與單菌發(fā)酵相比，多菌株混合發(fā)酵能顯著增強(qiáng)白酒的風(fēng)味。例如，在豉香型白酒中引入P. anomala和Lactobacillus plantarum混合發(fā)酵，能有效增強(qiáng)其風(fēng)味；利用P. kudriavzevii和Saccharomyces cerevisiae混合發(fā)酵能顯著提高濃香型白酒發(fā)酵中其他微生物的乳酸耐受性。將S. cerevisiae和Wickerhamomyces anomalus以特定比例混合發(fā)酵，能顯著提高醬香型白酒中乙酸乙酯的含量。然而，當(dāng)前的研究主要集中在混菌發(fā)酵對(duì)風(fēng)味成分的影響，尚未深入探討產(chǎn)酯酶菌株在混菌發(fā)酵中的代謝變化機(jī)制。本研究將產(chǎn)酯酶的菌株P(guān). kudriavzevii與產(chǎn)己酸的菌株C. butyricum進(jìn)行混菌發(fā)酵，并利用TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)JM5-4進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與單菌發(fā)酵相比，JM5-4在混菌發(fā)酵過程中的生長與代謝能力顯著提升，其產(chǎn)酯酶能力也有所增強(qiáng)。

JM5-4在混菌發(fā)酵過程中，三羧酸循環(huán)和二羧酸及乙醛酸循環(huán)相關(guān)酶的全部DEPs表達(dá)上調(diào)，有效提升了其生長代謝水平和繁殖能力。伴隨著代謝流速的提高，JM5-4對(duì)底物（如糖類）的轉(zhuǎn)化利用效率也得到了強(qiáng)化，同時(shí)促進(jìn)了二次代謝物（有機(jī)酸、香味物質(zhì)等）的合成。值得注意的是，高濃度的有機(jī)酸可能導(dǎo)致質(zhì)子與陰離子平衡的破壞，從而影響細(xì)胞膜、核糖體RNA、DNA以及酶的功能，從而阻礙微生物的正常生長和代謝。

P. kudriavzevii JM5-4展現(xiàn)出良好的酯酶合成能力。在混菌發(fā)酵后，部分酯酶相關(guān)DEPs的表達(dá)上調(diào)，從而顯著提升了酯酶的合成能力。酯酶能夠催化脂肪酸和醇的轉(zhuǎn)化生成酯類化合物，酯酶的上調(diào)可能增強(qiáng)香氣成分的合成，從而影響白酒的質(zhì)量。核糖核酸酶（EC: 3.1.26.4）是一種磷酸單酯水解酶，具有修飾基因的功能，能影響各種類型的編碼和非編碼RNA的成熟。在細(xì)胞的多種生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括DNA的復(fù)制、修復(fù)以及RNA的處理。JG組涉及核糖核酸酶的DEPs上調(diào)，表明混菌發(fā)酵能促進(jìn)核糖核酸酶的合成，加速細(xì)胞代謝。海藻糖-6-磷酸磷酸酶（EC: 3.1.3.12）能催化水解反應(yīng)去除磷酸基團(tuán)，形成海藻糖。該酶的DEPs上調(diào)，表明混菌發(fā)酵促進(jìn)海藻糖磷酸酶的合成，從而催化多糖合成與能量代謝。SFGH（EC: 3.1.2.12，酯酶D）是一類能夠水解羧酸酯鍵的酶，具有多態(tài)性，能催化S-甲酰谷胱甘肽水解成甲酸鹽和谷胱甘肽，對(duì)含有硫酯鍵和酯鍵的底物具有更廣泛的酯酶活性。研究表明，SFGH在真核生物和原核生物的甲醛解毒中發(fā)揮作用，被認(rèn)為參與谷胱甘肽依賴性甲醛氧化途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，JG組涉及SFGH的DEPs全部上調(diào)，可能意味著混菌發(fā)酵會(huì)加速SFGH的合成，從而促進(jìn)甲酸鹽與谷胱甘肽的生成、催化谷胱甘肽依賴性甲醛氧化，以降低環(huán)境來源或甲醇代謝產(chǎn)生的甲醛含量。在釀酒發(fā)酵過程中，微生物代謝產(chǎn)生過多的甲醇及甲醛含量會(huì)影響白酒的良好風(fēng)味品質(zhì)，而SFGH的合成可很好地解決這一問題，表明混菌發(fā)酵能減少白酒釀造過程中所產(chǎn)生的有害物質(zhì)，為白酒的質(zhì)量控制提供一定理論基礎(chǔ)。

結(jié)論

P. kudriavzevii JM5-4單菌發(fā)酵（J組）與混菌發(fā)酵（JG組）總共鑒定到3 164 個(gè)蛋白，355 個(gè)DEPs，其中包括糖酵解/糖異生（己糖激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶）、三羧酸代謝（檸檬酸合酶、烏頭酸鹽水合酶、富馬酸水合酶、蘋果酸脫氫酶等）、乙醛酸和二羧酸代謝（羥基丙酮酸還原酶、乙醛酸還原酶等）在內(nèi)的DEPs全部上調(diào)，表明該菌在混菌發(fā)酵條件下其生長代謝能力顯著提升，還能促進(jìn)酸類物質(zhì)的合成。核糖核酸酶與海藻糖磷酸酶的大量合成同樣促進(jìn)了菌株細(xì)胞代謝與能量代謝。此外，SFGH的大量合成促進(jìn)了甲酸鹽與谷胱甘肽的生成，加速甲醛的氧化，能顯著提升白酒的風(fēng)味品質(zhì)與安全。綜上，本研究為探究白酒釀造過程中混菌發(fā)酵的代謝機(jī)制及其對(duì)風(fēng)味品質(zhì)的影響提供了一定的理論方法，對(duì)未來的應(yīng)用與研究方向具有積極的推動(dòng)作用。后續(xù)研究可以聚焦于優(yōu)化這些代謝途徑在實(shí)際釀造過程中的應(yīng)用，以進(jìn)一步提升白酒的風(fēng)味特性和整體品質(zhì)。

本文《串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽定量蛋白質(zhì)組學(xué)解析產(chǎn)酯酶

Pichia kudriavzevii

實(shí)習(xí)編輯：王雨婷；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)