撰文丨細(xì)胞工程師

PD-1/PD-L1檢查點(diǎn)阻斷療法徹底改變了腫瘤治療格局，但其臨床應(yīng)答率有限且耐藥頻發(fā)，具體作用機(jī)制尚未完全闡明【1】。傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為，PD-1是T細(xì)胞功能的“剎車(chē)”，其持續(xù)高表達(dá)于腫瘤微環(huán)境（TME）中，導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭【2】。然而，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，一部分表達(dá)TCF-1和PD-1的CD8+ T細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特性，是維持持久抗腫瘤免疫應(yīng)答和檢查點(diǎn)阻斷療法響應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞來(lái)源【3,4】。這些細(xì)胞如何在持續(xù)的抗原刺激下維持其“干性”而非走向終末分化，是免疫學(xué)領(lǐng)域的核心問(wèn)題。

近日，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）過(guò)敏與傳染病研究所（NIAID）的Ronald N. Germain和Jyh Liang Hor共同領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上發(fā)表了題為Inhibitory PD-1 axis maintains high-avidity stem-like CD8+ T cells的最新研究論文。該研究通過(guò)三維多重免疫熒光成像技術(shù)，在活體水平揭示了腫瘤引流淋巴結(jié)（tdLN）內(nèi)存在由I型傳統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞（cDC1）構(gòu)成的“晚期抗原呈遞龕”，其中駐留著一群獨(dú)特的PD-1high SLAMF6high TCF-1+ 干細(xì)胞樣CD8+ T細(xì)胞。出乎意料的是，持續(xù)存在的PD-1信號(hào)并非簡(jiǎn)單地抑制這些細(xì)胞，而是通過(guò)精細(xì)調(diào)控TCR信號(hào)強(qiáng)度，選擇性維持并擴(kuò)增高親和力TCR克隆，使其保持干細(xì)胞樣狀態(tài)，成為效應(yīng)T細(xì)胞再生的儲(chǔ)備庫(kù)。而徹底的PD-1阻斷會(huì)破壞這一平衡，導(dǎo)致高親和力干細(xì)胞樣CD8+ T細(xì)胞（TSL）終末分化或死亡，可能損害長(zhǎng)期免疫監(jiān)視能力。這項(xiàng)研究顛覆了對(duì)PD-1在淋巴組織內(nèi)功能的傳統(tǒng)認(rèn)知，為優(yōu)化檢查點(diǎn)免疫治療策略提供了全新理論基礎(chǔ)。

通常認(rèn)為，持續(xù)強(qiáng)烈的TCR信號(hào)會(huì)驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞向終末效應(yīng)狀態(tài)分化，而PD-1的上調(diào)是對(duì)持續(xù)刺激的反饋抑制。那么，在tdLN這個(gè)抗原持續(xù)存在的部位，高表達(dá)PD-1的TSL是如何避免終末分化，維持其干細(xì)胞特性的？PD-1在這一過(guò)程中扮演的是純粹的抑制角色，還是具有更復(fù)雜的功能？為了解答這些問(wèn)題，則需要能夠在完整組織環(huán)境中動(dòng)態(tài)觀(guān)察細(xì)胞間的相互作用的高分辨率技術(shù)。為此，研究團(tuán)隊(duì)建立了可對(duì)光學(xué)透明的300μm厚tdLN組織切片進(jìn)行多達(dá)多種種蛋白標(biāo)記物的染色與成像，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率下，上百萬(wàn)細(xì)胞的空間分布、表型及相互作用網(wǎng)絡(luò)分析的三維（3D）多重免疫熒光成像技術(shù)平臺(tái)。通過(guò)高分辨率3D成像，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，在腫瘤植入后第8天，tdLN的T細(xì)胞區(qū)形成了由cDC1聚集的特定區(qū)域。令人驚訝的是，大量已經(jīng)歷多輪增殖的抗原特異性O(shè)T-I T細(xì)胞，仍緊密簇?fù)碓谶@些cDC1周?chē)＿@群細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物TCF-1和SLAMF6，同時(shí)高表達(dá)激活標(biāo)志物PD-1和BATF，且核內(nèi)存在轉(zhuǎn)錄因子NFAT（TCR信號(hào)活化的標(biāo)志），證明它們?cè)诔醮渭せ顢?shù)天后，仍在持續(xù)接收抗原信號(hào)。這群細(xì)胞被定義為PD-1high SLAMF6high TSL。重要的是，這類(lèi)細(xì)胞幾乎只存在于tdLN，而在脾臟、非引流淋巴結(jié)或腫瘤組織中均未檢測(cè)到。這提示tdLN中的cDC1形成了一個(gè)特殊的微環(huán)境，能夠長(zhǎng)期“儲(chǔ)留”并持續(xù)刺激高干性的T細(xì)胞。

傳統(tǒng)觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為高親和力TCR信號(hào)驅(qū)動(dòng)效應(yīng)分化。然而，本研究則發(fā)現(xiàn)了相反的證據(jù)，在tdLN的TSL中，PD-1的表達(dá)水平與推斷的TCR親和力指數(shù)呈強(qiáng)烈正相關(guān)。親和力越高的TSL亞群，其PD-1和SLAMF6的表達(dá)也越高。進(jìn)一步的時(shí)間序列研究結(jié)果顯示，從腫瘤植入第6天到第13天，TSL及其衍生的效應(yīng)T細(xì)胞（Teff）的平均TCR親和力逐漸進(jìn)化提升。這表明，cDC1構(gòu)成的抗原呈遞龕是一個(gè)“進(jìn)化場(chǎng)”，能夠隨著時(shí)間的推移，選擇性擴(kuò)增和富集更高親和力的TCR克隆。而PD-1在其中則扮演了“調(diào)諧器”的角色。高分辨率3D成像顯示，在TSL與cDC1的接觸界面，PD-1形成微簇并與cDC1上的PD-L1共定位，表明活躍的PD-1抑制信號(hào)正在發(fā)生。這種PD-1介導(dǎo)的抑制，很可能是對(duì)高親和力TCR強(qiáng)烈信號(hào)的負(fù)反饋，通過(guò)適度削弱信號(hào)強(qiáng)度，防止細(xì)胞過(guò)度激活而走向終末分化或活化誘導(dǎo)死亡，從而維持其干細(xì)胞樣狀態(tài)和持續(xù)增殖能力。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PD-1的作用，研究團(tuán)隊(duì)使用了抗PD-L1/PD-L2聯(lián)合抗體或抗PD-1抗體針對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行阻斷治療。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷后tdLN內(nèi)抗原特異性T細(xì)胞（包括TSL和Teff）大量擴(kuò)增，但TSL的干性標(biāo)志物TCF-1和SLAMF6表達(dá)顯著下調(diào)。更為關(guān)鍵的是，PD-1阻斷后，SLAMF6+ TSL數(shù)量銳減，且該細(xì)胞亞群的平均TCR親和力亦顯著降低。貝葉斯模型分析結(jié)果表明，PD-1阻斷導(dǎo)致高親和力克隆分化為T(mén)eff細(xì)胞，抑或發(fā)生凋亡，從而為低親和力克隆的擴(kuò)張“騰出空間”。即使在停止阻斷抗體治療9-10天后，這種高親和力SLAMF6+ TSL的丟失和克隆組成的改變也無(wú)法恢復(fù)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，僅阻斷PD-L1能導(dǎo)致中度的抗腫瘤效果，以及脾臟TSL和Teff細(xì)胞適度擴(kuò)增，但并未造成SLAMF6+ TSL數(shù)量和親和力的顯著下降。而僅阻斷PD-L2則效果微弱。這表明，完全破壞PD-1抑制軸是驅(qū)動(dòng)強(qiáng)效抗腫瘤效應(yīng)所必需，但同時(shí)也導(dǎo)致了高干性T細(xì)胞前體的丟失。另外，鑒于PD-1也可以高表達(dá)于活化的CD4+ T細(xì)胞，研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)開(kāi)展了清除CD4+ T細(xì)胞（包括輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）的研究，研究發(fā)現(xiàn)PD-1阻斷導(dǎo)致的TSL干性喪失和克隆偏移現(xiàn)象，并不依賴(lài)于CD4+T細(xì)胞的存在。

這項(xiàng)研究從根本上挑戰(zhàn)了關(guān)于PD-1功能和T細(xì)胞命運(yùn)的既有范式，在tdLN內(nèi)，PD-1信號(hào)并非單純的“功能抑制”信號(hào)，而是一個(gè)精細(xì)的“信號(hào)調(diào)節(jié)器”。它通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制，將高親和力TCR信號(hào)強(qiáng)度調(diào)節(jié)在適宜范圍內(nèi)，從而維持T細(xì)胞的干性特性、自我更新能力和長(zhǎng)期存活。該研究揭示了tdLN是抗腫瘤T細(xì)胞應(yīng)答的“訓(xùn)練營(yíng)”和“優(yōu)質(zhì)種子庫(kù)”。cDC1構(gòu)成的微環(huán)境持續(xù)進(jìn)行著親和力依賴(lài)性選擇，確保將最具潛力的高親和力干細(xì)胞樣T細(xì)胞克隆保存下來(lái)，并源源不斷地產(chǎn)生高親和力效應(yīng)細(xì)胞并輸送至抗腫瘤前線(xiàn)。該研究也為PD-1治療后出現(xiàn)的“克隆替換”現(xiàn)象（即原有克隆消失，新克隆出現(xiàn)）提供了可能的機(jī)制解釋【5】。徹底阻斷可能永久性消除了機(jī)體最優(yōu)的（高親和力）抗腫瘤T細(xì)胞前體儲(chǔ)備，而新補(bǔ)充的或擴(kuò)張的低親和力克隆可能由于抗腫瘤能力不足，導(dǎo)致療效無(wú)法長(zhǎng)期維持。這或可解釋為何部分患者初始響應(yīng)后復(fù)發(fā)，且再治療的療效不佳。

綜上所述，本研究利用先進(jìn)的3D成像技術(shù)，在體揭示了PD-1信號(hào)軸在維持抗腫瘤免疫“精銳部隊(duì)”（PD-1high SLAMF6high TSL）中的關(guān)鍵作用。它不僅刷新了我們對(duì)免疫檢查點(diǎn)分子生物學(xué)功能的理解，更重要的是，為改善當(dāng)前免疫治療策略、提高長(zhǎng)期療效和克服耐藥提供了至關(guān)重要的理論依據(jù)。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41586-025-09440-x

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

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