該綜述聚焦 2020-2025 年有機小分子熒光探針在腦缺血再灌注損傷（CIRI）機制研究中的應用，核心圍繞活性氧（ROS）、活性硫（RSS）及相關酶類、微環(huán)境參數(shù)（pH、黏度）的檢測，將探針按單標志物激活和微環(huán)境響應協(xié)同兩類設計策略分類，強調(diào)探針通過優(yōu)化響應位點（如硼酸苯酯、二硒鍵）和靶向修飾提升血腦屏障（BBB）穿透能力的關鍵進展，同時指出個體差異適配、體內(nèi)分布不均、臨床轉(zhuǎn)化等現(xiàn)存挑戰(zhàn)，展望了結合人工智能與多模態(tài)成像的診療一體化發(fā)展方向，為 CIRI 的機制解析與精準診療提供重要工具和參考。

圖1腦缺血損傷級聯(lián)反應機制：谷氨酸興奮性毒性、炎癥反應與血腦屏障的關聯(lián)

一、思維導圖

二、熒光探針的分類與核心應用（2020-2025年）

該綜述按設計策略將探針分為兩類：

• 單標志物激活型探針

這類探針以單一生物標志物為檢測目標，通過特異性響應位點與目標分子作用產(chǎn)生熒光信號，核心應用聚焦于活性氧（ROS）、活性硫（RSS）及相關酶類的精準檢測，具體特性如下：

• 檢測目標：涵蓋多類與腦缺血再灌注損傷（CIRI）相關的生物分子，包括 ROS（過氧化氫 H?O?、次氯酸 HClO、羥基自由基?OH、過氧亞硝基陰離子 ONOO?、超氧陰離子 O???）、RSS（谷胱甘肽 GSH、半胱氨酸 Cys、高半胱氨酸 Hcy 等生物硫醇），以及酶類（硫氧還蛋白還原酶 TrxR1/2、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NAD (P) H）。

• 核心設計：采用特異性響應基團實現(xiàn)靶向識別，如硼酸苯酯（識別 H?O?）、酰肼（識別 HClO）、二硒鍵（識別 RSS）、二硫雜環(huán)戊烷（識別 TrxR）等；結合分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、鍵能轉(zhuǎn)移（TBET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）等光學響應機制，提升信號靈敏度與特異性。

• 關鍵特性：部分探針具備近紅外成像能力，有效降低生物組織干擾；通過修飾親疏水平衡基團、優(yōu)化分子理化性質(zhì)，提升血腦屏障（BBB）穿透性，部分探針體外 BBB 穿透率達 57%（如探針 12）；檢測限極低，最低可達 3.88 nM（如檢測 O???的探針 14），熒光增強倍數(shù)范圍為 30-425 倍，可實現(xiàn)目標分子的實時、原位監(jiān)測；部分探針具備亞細胞靶向性（線粒體、溶酶體），進一步提升檢測精準度。

• 微環(huán)境響應協(xié)同型探針

這類探針針對 CIRI 過程中微環(huán)境參數(shù)（pH、黏度）與生物標志物的協(xié)同變化設計，可實現(xiàn)多參數(shù)同步檢測，核心應用及特性如下：

• 檢測目標：聚焦微環(huán)境參數(shù)與生物標志物的協(xié)同監(jiān)測，包括 pH 與 ONOO?（關聯(lián)自噬過程）、黏度與 ROS（O???、H?O?）等。

• 核心設計：基于微環(huán)境變化與生物標志物的級聯(lián)反應機制構建，如 pH 協(xié)同型探針（探針 26）通過 “ONOO?氧化激活 + 酸性環(huán)境質(zhì)子化增強” 的雙激活機制，實現(xiàn)自噬過程的全程監(jiān)測；黏度協(xié)同型探針通過限制二面角旋轉(zhuǎn)響應黏度變化，同時整合 ROS 識別位點，實現(xiàn)多參數(shù)獨立檢測（如探針 28 通過不同波長熒光信號區(qū)分線粒體黏度與 O???水平）。

• 關鍵特性：具備高時空分辨率，可捕捉 CIRI 過程中微環(huán)境與生物標志物的動態(tài)關聯(lián)；部分探針（如探針 30）采用近紅外熒光發(fā)色團， Stokes 位移達 290 nm，有效減少自吸收干擾；通過優(yōu)化分子結構實現(xiàn)線粒體、溶酶體等亞細胞靶向，且 BBB 穿透性優(yōu)異，可在活體腦內(nèi)實現(xiàn)精準成像；熒光響應顯著，如探針 30 對黏度的熒光增強倍數(shù)達 418 倍，能清晰反映 CIRI 過程中氧化應激與微環(huán)境變化的關聯(lián)。

三、探針的核心設計優(yōu)化與優(yōu)勢

• 響應位點優(yōu)化：通過引入硼酸苯酯（H?O?識別）、二硒鍵（RSS 識別）、酰肼（HClO 識別）等特異性響應基團，提升探針對目標分子的選擇性。

• BBB穿透性提升：通過修飾親疏水平衡基團（如三乙二醇單甲醚）、優(yōu)化分子量和電荷，部分探針實現(xiàn)高效 BBB 穿透，如探針 12 的體外 BBB 穿透率達 57%，探針 13 的Papp 值達 1.4623×10?? cm/s。

• 光學性能升級：采用近紅外熒光發(fā)色團、比率型成像、化學發(fā)光 / 生物發(fā)光技術，降低生物組織干擾，提升信號信噪比；部分探針 Stokes 位移達 155 nm（探針 6）、290 nm（探針 30），有效減少光譜重疊。

• 功能拓展：部分探針實現(xiàn) “檢測 - 標記”“成像 - 治療” 協(xié)同，如探針 11 在檢測 ONOO?的同時釋放 CO 發(fā)揮抗氧化保護作用。

四、現(xiàn)存挑戰(zhàn)

個體差異適配難題：小分子探針靈敏度極高，但生理狀態(tài)下 ROS 濃度動態(tài)范圍廣，易出現(xiàn)信號飽和，需開發(fā)可調(diào)反應閾值的智能系統(tǒng)。

體內(nèi)分布不均問題：探針的藥代動力學（分子量、電荷、溶解度）調(diào)控不足，導致目標位點富集量不足，影響檢測準確性。

微環(huán)境適應性有限：現(xiàn)有探針多針對單一微環(huán)境參數(shù)（pH / 黏度），對 CIRI 過程中動態(tài)變化的復雜微環(huán)境（多參數(shù)協(xié)同變化）適配性不足。

臨床轉(zhuǎn)化瓶頸：探針的長期生物相容性、規(guī)?；铣晒に嚒Ⅲw內(nèi)代謝與清除機制尚未完全明確，缺乏標準化的臨床轉(zhuǎn)化評估體系。

五、未來展望

技術融合創(chuàng)新：結合人工智能實現(xiàn)探針分子設計優(yōu)化與篩選，加速研發(fā)周期；融合多模態(tài)成像技術，提升 CIRI 病理機制解析的精準度。

功能一體化發(fā)展：開發(fā) “成像 - 診斷 - 治療 - 監(jiān)測” 一體化平臺，實現(xiàn) CIRI 的精準診療協(xié)同。

臨床轉(zhuǎn)化推進：建立統(tǒng)一的探針療效與生物安全性評估標準，明確規(guī)?；铣膳c體內(nèi)代謝機制，推動探針從預臨床研究向臨床應用轉(zhuǎn)化。

應用場景拓展：實現(xiàn)手術中腦組織結構活性的實時評估，為 CIRI 相關疾病的個體化治療提供技術支撐。

4.關鍵問題

問題 1：近五年（2020-2025 年）CIRI 研究中，單標志物激活型熒光探針的核心檢測目標及代表性響應機制是什么？

答案：核心檢測目標包括三類：①ROS（H?O?、HClO、·OH、ONOO?、O??·）；②RSS（GSH、Cys、Hcy等生物硫醇）；③酶類（硫氧還蛋白還原酶 TrxR1/2、NAD (P) H）。代表性響應機制包括：硼酸苯酯與 H?O?的親核攻擊 - 酯鍵斷裂反應、二硒鍵與 RSS 的硒硫交換反應、酰肼與 HClO 的氧化反應，以及分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）、鍵能轉(zhuǎn)移（TBET）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）等光學響應機制。

問題 2：為解決 BBB 穿透性差的關鍵問題，熒光探針采取了哪些優(yōu)化策略？這些策略帶來了哪些具體效果？

答案：優(yōu)化策略主要包括：①修飾親疏水平衡基團（如三乙二醇單甲醚）；②優(yōu)化分子理化性質(zhì)（分子量、電荷、脂水分配系數(shù) Log P）；③引入腦靶向基團（如組胺受體激動劑藥效團）。具體效果：部分探針實現(xiàn)高效 BBB 穿透，如探針 12 的Log P=2.04，體外 BBB 穿透率達 57%；探針 13 的 Log P=2.02，Papp 值達 1.4623×10?? cm/s；探針 14 的 BBB 滲透率達 1.436×10?? cm?s?1，可有效富集于腦內(nèi)損傷區(qū)域并實現(xiàn)目標分子成像。

問題 3：當前 CIRI 相關熒光探針面臨的核心轉(zhuǎn)化瓶頸是什么？未來突破方向有哪些？

答案：核心轉(zhuǎn)化瓶頸包括：①長期生物相容性未明確，缺乏規(guī)?；铣晒に?；②體內(nèi)代謝途徑與清除機制研究不足，潛在生物安全性風險；③缺乏統(tǒng)一的療效與生物安全性評估標準，難以從預臨床向臨床轉(zhuǎn)化。未來突破方向：①開展探針長期生物相容性、體內(nèi)代謝機制的系統(tǒng)研究，優(yōu)化規(guī)模化合成工藝；②建立標準化的探針性能評估體系（包括靈敏度、特異性、生物安全性等指標）；③開發(fā) “診療一體化” 探針平臺，結合光動力治療等功能，提升臨床應用價值；④融合人工智能與多模態(tài)成像技術，實現(xiàn)探針分子的精準設計與病理機制的深度解析。

原文鏈接：10.1021/cbmi.5c00254

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