撰文 | 言笑

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎性脫髓鞘疾病，影響著全球近300萬(wàn)人。目前， MS的診斷主要依賴于 McDonald 標(biāo)準(zhǔn) （國(guó)際公認(rèn)的多發(fā)性硬化診斷指南，由國(guó)際專家小組制定并定期更新。其核心邏輯是在排除其他疾病的前提下，通過(guò)證明病灶的“空間多發(fā)性”（中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同部位受損）和“時(shí)間多發(fā)性”（病情反復(fù)發(fā)作或MRI顯示新舊病灶并存）來(lái)確立診斷） ， 其中腦脊液中的寡克隆帶（oligoclonal bands，OCBs）是最核心的生物學(xué)標(biāo)志物【1】。然而，這一診斷體系存在顯著的“灰色地帶”：約10-20%的患者表現(xiàn)為OCB陰性，導(dǎo)致臨床鑒別診斷極為困難——他們可能被誤診為其他炎性疾病或被漏診【2-4】。而現(xiàn)有的替代標(biāo)志物如k游離輕鏈（kappa free light-chain,kFLC）雖然在總體人群中表現(xiàn)尚可，但在OCB陰性個(gè)體中敏感度不足，無(wú)法解決這一臨床困境【5-6】。另一方面，MS的疾病進(jìn)程存在顯著異質(zhì)性，從復(fù)發(fā)緩解型（RRMS）向繼發(fā)進(jìn)展型（SPMS）的轉(zhuǎn)化時(shí)機(jī)難以預(yù)測(cè)，而新興的進(jìn)展靶向治療（如tolebrutinib）又需要早期識(shí)別可能獲益的患者，但傳統(tǒng)的臨床指標(biāo)（復(fù)發(fā)史、MRI病灶負(fù)荷、殘疾評(píng)分）預(yù)測(cè)價(jià)值有限，往往需要長(zhǎng)期隨訪才能做出判斷。那么，能否通過(guò)腦脊液蛋白質(zhì)組的深度解析，找到能夠解決上述臨床痛點(diǎn)的分子標(biāo)志物呢？

近日，來(lái)自德國(guó)馬普生化研究所的Matthias Mann團(tuán)隊(duì)聯(lián)合慕尼黑工業(yè)大學(xué)的Bernhard Hemmer團(tuán)隊(duì)和Christiane Gasperi團(tuán)隊(duì)在Cell雜志發(fā)表了一篇題為Large-scale proteomics across neurological disorders uncovers biomarker panel and targets in multiple sclerosis的研究論文。作者通過(guò)先進(jìn)的質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)超過(guò)5000份腦脊液樣本進(jìn)行了深度蛋白質(zhì)組學(xué)分析，首次闡明血腦屏障功能障礙是腦脊液蛋白組變異的首要來(lái)源，其影響遠(yuǎn)超疾病本身；在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的22蛋白標(biāo)志物組合，在OCB陰性的MS患者中診斷性能顯著優(yōu)于現(xiàn)有臨床指標(biāo)；更重要的是，通過(guò)蛋白質(zhì)組“偽時(shí)間”分析，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)發(fā)緩解型向繼發(fā)進(jìn)展型多發(fā)性硬化轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)，轉(zhuǎn)化時(shí)間與蛋白組分期呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究不僅為MS的精準(zhǔn)診斷和進(jìn)展預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的新工具，更建立了從大規(guī)模發(fā)現(xiàn)到臨床轉(zhuǎn)化研究的完整范式，為神經(jīng)免疫疾病的精準(zhǔn)醫(yī)療開(kāi)辟了新路徑。

構(gòu)建了迄今最大規(guī)模的腦脊液蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)（圖1）： 研究團(tuán)隊(duì)依托慕尼黑工業(yè)大學(xué)神經(jīng)生物樣本庫(kù)，收集了超過(guò)5000份高質(zhì)量CSF樣本，涵蓋了多發(fā)性硬化、感染性疾病、神經(jīng)退行性疾病等廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)疾病譜系。為實(shí)現(xiàn)這一大規(guī)模隊(duì)列的深度分析，團(tuán)隊(duì)首先在實(shí)驗(yàn)流程上實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵突破：通過(guò)整合Agilent Bravo自動(dòng)化液體處理工作站，將樣品前處理通量從傳統(tǒng)手工操作的12樣本/天大幅提升至60樣本/天；后期引入Orbitrap Astral質(zhì)譜儀后，通量進(jìn)一步達(dá)到100樣本/天，為大規(guī)模隊(duì)列分析提供了技術(shù)保障。在質(zhì)譜檢測(cè)層面，研究采用了雙平臺(tái)互補(bǔ)策略：timsTOF Pro 2平臺(tái)采用優(yōu)化后的dia-PASEF模式，在21分鐘梯度內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效分離；Orbitrap Astral平臺(tái)則結(jié)合FAIMS接口和150個(gè)隔離窗口，在11.5分鐘內(nèi)完成單樣本檢測(cè)，顯著縮短了分析時(shí)間。為獲得高覆蓋率的鑒定結(jié)果，譜圖庫(kù)的構(gòu)建采用了實(shí)驗(yàn)餾分與AlphaPeptDeep深度學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)相結(jié)合的創(chuàng)新策略，并通過(guò)LOESS回歸對(duì)兩個(gè)平臺(tái)的離子庫(kù)進(jìn)行合并優(yōu)化，確保了數(shù)據(jù)的一致性和完整性。最終的數(shù)據(jù)產(chǎn)出顯示了優(yōu)異的技術(shù)性能：timsTOF平臺(tái)平均每樣本鑒定約1500種蛋白質(zhì)，而Astral平臺(tái)進(jìn)一步提升至2100種，其中包含約150種蛋白亞型。在檢測(cè)穩(wěn)定性方面，超過(guò)1000種蛋白在80%以上的樣本中可穩(wěn)定檢出；約800種蛋白的全流程變異系數(shù)低于20%，Astral平臺(tái)更有1000種蛋白達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)，表明數(shù)據(jù)的定量精度高、重復(fù)性好。主成分分析顯示，生物學(xué)效應(yīng)是驅(qū)動(dòng)樣本變異的第一主成分，證實(shí)數(shù)據(jù)質(zhì)量足以支撐后續(xù)的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)。

圖1. 研究設(shè)計(jì)及蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集特征

揭示了腦脊液蛋白組的主要變異來(lái)源是血腦屏障功能障礙： 研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)多元線性回歸模型系統(tǒng)評(píng)估了診斷組、年齡、性別、QAlb（albumin ratio）等協(xié)變量對(duì)腦脊液蛋白質(zhì)組變異的影響，并在timsTOF、Astral及獨(dú)立OLINK數(shù)據(jù)集中進(jìn)行跨平臺(tái)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，血腦屏障功能障礙解釋的蛋白質(zhì)組變異度是疾病本身的三倍，且這一趨勢(shì)在所有平臺(tái)中高度一致，確立QAlb為腦脊液蛋白質(zhì)組學(xué)研究中必須校正的首要混雜因素。通過(guò)匹配的CSF與血漿蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)對(duì)比，作者發(fā)現(xiàn)了其內(nèi)在原因：CSF是血漿的超濾液，稀釋倍數(shù)高達(dá)約100倍，約70%的CSF蛋白與血漿重疊，且總蛋白濃度與QAlb呈極強(qiáng)正相關(guān)。這意味著，CSF中多數(shù)蛋白的濃度波動(dòng)，主要取決于血腦屏障的通透性。若不校正QAlb，直接比較兩組患者的蛋白濃度，觀測(cè)到的差異可能僅僅是屏障功能差異的反映，而非真實(shí)的疾病病理變化。研究還特別指出，對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行全蛋白組歸一化處理，會(huì)使非血漿來(lái)源的腦源性蛋白“顯得”降低，若未校正QAlb，同樣可能扭曲真實(shí)的生物學(xué)發(fā)現(xiàn)。針對(duì)這一混雜效應(yīng)，研究團(tuán)隊(duì)提出了三種實(shí)用的校正策略：（1）回歸校正：在統(tǒng)計(jì)模型中納入QAlb作為協(xié)變量，是校正混雜因素的金標(biāo)準(zhǔn)；（2）替代指標(biāo)：使用ITIH1和C5這兩個(gè)蛋白作為QAlb的可靠替代指標(biāo)，適用于QAlb數(shù)據(jù)缺失的情況；（3）選擇性歸一化：基于不受QAlb影響的特定蛋白子集進(jìn)行歸一化。此外，研究還厘清了其他協(xié)變量的影響：年齡調(diào)控?cái)?shù)百至上千種蛋白，部分效應(yīng)與QAlb相關(guān)；而性別、紅細(xì)胞污染、白細(xì)胞計(jì)數(shù)則調(diào)控特定的蛋白集，且這些效應(yīng)與疾病效應(yīng)基本正交，在不同疾病中表現(xiàn)一致。

開(kāi)發(fā)了22蛋白診斷組合： 為解決OCB陰性MS患者的鑒別診斷難題，研究團(tuán)隊(duì)從5000余份樣本中選取約1600例分層子集（包括MS、其他炎性疾病和對(duì)照），按年齡、性別、QAlb、IgG比值、OCB狀態(tài)和白細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行匹配，并采用Orbitrap Astral平臺(tái)重新檢測(cè)獲得每樣本2100種蛋白的深度覆蓋數(shù)據(jù)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)XGBoost多分類模型結(jié)合嵌套交叉驗(yàn)證和特征遞歸消除算法，初步篩選出30個(gè)候選特征蛋白。為實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步建立了靶向質(zhì)譜檢測(cè)方法：基于變異系數(shù)和信噪比，從每個(gè)候選蛋白中優(yōu)選出1條特征肽段，最終鎖定了一個(gè)包含22條肽段（代表22種蛋白）的精簡(jiǎn)診斷組合。在獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列中，這一22蛋白組合展現(xiàn)出優(yōu)異的診斷性能。在全樣本分析中，其診斷準(zhǔn)確率與包含OCB狀態(tài)、IgG比值等指標(biāo)的臨床常規(guī)模型相當(dāng)。而在最具挑戰(zhàn)的OCB陰性患者亞組中，該蛋白組合的診斷效能顯著超越臨床常規(guī)模型。這一突破性結(jié)果為OCB陰性患者提供了客觀、精準(zhǔn)的分子診斷依據(jù)。從生物學(xué)功能看，該組合中的22種蛋白廣泛覆蓋了MS的核心病理通路：髓鞘/軸突損傷（MBP、NEFM）、小膠質(zhì)細(xì)胞/先天免疫（CHIT1、C1QB）、B細(xì)胞相關(guān)（JCHAIN、IGKC、TNFRSF17、FCRL5）、T細(xì)胞相關(guān)（CD7、CD27）、基質(zhì)重塑（MMP9、SDC1），其中FCRL5和CTSW是既往研究中未受充分重視的蛋白，為理解MS免疫機(jī)制提供了新視角。此外，靶向方法的驗(yàn)證數(shù)據(jù)顯示，該組合的生物效應(yīng)差異是技術(shù)流程變異系數(shù)的5-15倍，且對(duì)樣本加載量的變化具有穩(wěn)健性，表明其已具備在臨床實(shí)驗(yàn)室落地的可行性，有望為MS的個(gè)體化診斷與分層提供新一代工具。

建立了基于蛋白質(zhì)組的MS疾病分期體系： 研究團(tuán)隊(duì)借鑒單細(xì)胞測(cè)序的“偽時(shí)間”概念，通過(guò)訓(xùn)練一個(gè)區(qū)分MS患者與健康對(duì)照的XGBoost二分類模型，利用模型輸出的SHAP值，將所有樣本（包括患者和對(duì)照）排列成一個(gè)從健康到疾病的連續(xù)分子譜系。在這個(gè)譜系中，健康對(duì)照集中在早期，而MS患者分布在晚期；該“偽時(shí)間”與患者采樣時(shí)的殘疾評(píng)分顯著相關(guān)，且隨著偽時(shí)間推進(jìn)，免疫球蛋白負(fù)荷及神經(jīng)損傷標(biāo)志物（如MBP、NEFM）的檢出率逐漸增加，證實(shí)了該分期體系捕捉到了疾病特異性病理變化。在針對(duì)不同疾病亞型的分析中，研究通過(guò)分層子集消除了年齡和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響，發(fā)現(xiàn)：復(fù)發(fā)緩解型MS的標(biāo)志物主要涉及適應(yīng)性免疫，而進(jìn)展型MS則更多富集先天免疫特征。值得注意的是，RRMS相關(guān)蛋白中檢測(cè)到了EB病毒蛋白EBNA1的人源互作蛋白，進(jìn)展型MS（PMS）相關(guān)蛋白則富集補(bǔ)體系統(tǒng)和HLA-DRB1/5。通過(guò)滑動(dòng)窗口分析對(duì)蛋白軌跡進(jìn)行排序，最強(qiáng)的MS關(guān)聯(lián)蛋白包括MMP9、FCRL5和CTSW。其中，F(xiàn)CRL5作為非典型記憶B細(xì)胞標(biāo)志物，提示B細(xì)胞耗竭治療需平衡感染風(fēng)險(xiǎn)。在臨床結(jié)局關(guān)聯(lián)分析中，該偽時(shí)間體系展現(xiàn)出強(qiáng)大的預(yù)測(cè)能力：不僅與采樣時(shí)及遠(yuǎn)期（5-15年后）的殘疾評(píng)分顯著相關(guān)，最關(guān)鍵的是，后期由RRMS轉(zhuǎn)化為SPMS的患者，其在轉(zhuǎn)化前數(shù)年的基線偽時(shí)間已顯著高于未轉(zhuǎn)化者。從采樣到臨床確診轉(zhuǎn)化的中位時(shí)間為3年，且轉(zhuǎn)化時(shí)間與偽時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)。本研究首次證明，利用橫斷面隊(duì)列的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，即可構(gòu)建能預(yù)測(cè)數(shù)年后果疾病進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的分子分期工具。這為MS的個(gè)體化治療決策，特別是針對(duì)新興的“進(jìn)展獨(dú)立于復(fù)發(fā)活動(dòng)”靶向治療的患者分層，提供了全新思路。

綜上所述，本研究在MS生物標(biāo)志物領(lǐng)域取得了多項(xiàng)突破性進(jìn)展，其核心優(yōu)勢(shì)包含以下五個(gè)方面：（1）規(guī)模空前：基于5000余份腦脊液樣本、每樣本1500-2100種蛋白的深度覆蓋，為神經(jīng)疾病蛋白質(zhì)組學(xué)研究樹(shù)立了新標(biāo)桿；（2）技術(shù)突破：通過(guò)自動(dòng)化樣品前處理、高靈敏度質(zhì)譜和深度學(xué)習(xí)譜圖庫(kù)預(yù)測(cè)，實(shí)現(xiàn)了高通量、深覆蓋、高穩(wěn)健性的檢測(cè)流程；（3）系統(tǒng)解析：首次全面評(píng)估了血腦屏障功能障礙、年齡、性別等協(xié)變量對(duì)腦脊液蛋白組的影響，揭示了QAlb校正的必要性并提供替代方案；（4）臨床轉(zhuǎn)化：構(gòu)建了從發(fā)現(xiàn)隊(duì)列→分層特征選擇→靶向方法開(kāi)發(fā)→獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列驗(yàn)證的完整鏈條，為其他標(biāo)志物研究提供了可復(fù)制的范式；（5）預(yù)后價(jià)值：通過(guò)偽時(shí)間分析證實(shí)橫斷面隊(duì)列蛋白質(zhì)組可預(yù)測(cè)長(zhǎng)期殘疾進(jìn)展和RRMS→SPMS轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)，為新興的進(jìn)展靶向治療提供了患者分層工具。

本研究依舊存在一定的局限性。首先，質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)提供相對(duì)定量而非絕對(duì)濃度，部分蛋白因樣本基質(zhì)差異無(wú)法穩(wěn)定檢出，本研究策略聚焦于檢出的關(guān)聯(lián)而非缺失信號(hào)。其次，臨床驗(yàn)證具有遞進(jìn)性，雖已轉(zhuǎn)化為靶向檢測(cè)方法并在獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證，但真正的臨床認(rèn)證仍需建立基于已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的絕對(duì)定量方法，并在多中心、前瞻性隊(duì)列中驗(yàn)證臨床獲益，同時(shí)與MRI等影像學(xué)指標(biāo)整合確定最佳應(yīng)用場(chǎng)景。第三，診斷金標(biāo)準(zhǔn)存在局限性，依賴于長(zhǎng)期臨床隨訪和專家判斷，難以獲得尸檢確認(rèn)等終極金標(biāo)準(zhǔn)，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)年?duì)列設(shè)計(jì)、分層分析和多維度驗(yàn)證，最大限度地挖掘了現(xiàn)有隊(duì)列價(jià)值。第四，OCB陰性MS樣本的稀缺性，因其自然發(fā)生率低導(dǎo)致驗(yàn)證隊(duì)列中此類樣本有限，研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將部分發(fā)現(xiàn)隊(duì)列樣本轉(zhuǎn)入驗(yàn)證隊(duì)列的方式緩解了這一問(wèn)題。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10143-0

制版人： 十一

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