萜類化合物是一類 兼具 重要經(jīng)濟(jì) 價(jià)值 和生物學(xué) 功能 的天然產(chǎn)物 ，其中二萜類化合物以其復(fù)雜的環(huán)化反應(yīng)和顯著的生物活性而聞名，植物激素赤霉素、抗癌藥物紫杉醇均為其典型代表。 過(guò)去幾十年， 研究人員 主要從植物和真菌中尋找 新穎萜類化合物 靈感，而近年來(lái)，細(xì)菌作為極具潛力卻 尚 未被充分 挖掘 的萜類生物合成基因?qū)殠?kù)，正逐漸進(jìn)入科學(xué)家的視野。然而，如何從數(shù)以 萬(wàn) 計(jì)的候選基因中精準(zhǔn)篩選出具有活性的 萜類合 酶，并理解其催化 機(jī)制 ，是制約該領(lǐng)域 核心瓶頸。

近日 ， 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合成生物學(xué)研究所 卞光凱 團(tuán)隊(duì)聯(lián)合華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 徐娟 課題組和 波恩大學(xué) Jeroen S. Dickschat 課題組，在國(guó)際期刊 Journal of the American Chemical Society 上發(fā)表了題為Systematic Discovery of Bacterial Diterpene Synthases and Structure-Guided Functional Interconversion of ShHS and CbCS的最新研究成果 。該研究通過(guò)系統(tǒng)挖掘細(xì)菌二萜合酶，顯著拓展了細(xì)菌二萜天然產(chǎn)物的化學(xué)空間，并揭示了活性中心微環(huán)境對(duì)產(chǎn)物骨架分化的決定作用。

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原文鏈接： https://doi.org/10.1021/jacs.6c02649

在本研究中， 研究團(tuán)隊(duì) 首先 構(gòu)建了基于大規(guī)?；蚪M挖掘與工程酵母異源表達(dá)相結(jié)合的高通量篩選體系 ，對(duì) 313 個(gè)候選的細(xì)菌 I 型二萜合酶進(jìn)行了高通量功能篩選。通過(guò)一系列篩選，團(tuán)隊(duì) 成功鑒定出 16 個(gè)具有 二萜 活性的 萜類 合酶 （系列單萜、倍半萜和二倍半萜合酶功能驗(yàn)證仍在進(jìn)行中） ，并表征了 10 種 新 二萜化合物，其中包 含 5 種全新碳骨架 。這一發(fā)現(xiàn)大幅擴(kuò)展了細(xì)菌二萜類化合物的結(jié)構(gòu)多樣性和化學(xué)空間。

在此基礎(chǔ)上 ，研究人員進(jìn)一步聚焦來(lái)源于 Streptomyces hundungensis 的二萜合酶 ShHS 。通過(guò)密度泛函理論計(jì)算與精確同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，系統(tǒng)解析了該酶催化 GGPP 環(huán)化生成 hundungol A 及 系列 副產(chǎn)物的 完整 反應(yīng)機(jī)制。研究表明，該反應(yīng)首先通過(guò) GGPP 異構(gòu)化生成 GLPP ，為 后續(xù) 關(guān)鍵的 1,11- 環(huán)化反應(yīng) 奠定 構(gòu)象基礎(chǔ) ； 隨后經(jīng)連續(xù)環(huán)化、氫遷移和甲基遷移過(guò)程，形成關(guān)鍵 碳 正離子中間體 H 。在后續(xù)反應(yīng) 階段 ，不同的環(huán)化路徑和骨架重排決定了最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分支，其中包括一次罕見的 1,5- 氫遷移步驟。此外，研究還發(fā)現(xiàn) CbCS 的產(chǎn)物 2 雖 與上述機(jī)制具有相同的早期反應(yīng)步驟，但在中間體 H 處直接被水分子淬滅。

一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題隨之出現(xiàn)：是什么決定了 CbCS 和 ShHS 兩個(gè)酶在 分支點(diǎn) H 之后的反應(yīng)方向？為了回答這一問(wèn)題，研究人員成功解析了 CbCS 的 晶體 結(jié)構(gòu) ，同時(shí)借助 AlphaFold3 完成了 ShHS 的 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并將關(guān)鍵中間體 H 分別 對(duì)接 至 兩個(gè)酶的活性中心 開展比對(duì)分析 。結(jié)構(gòu)分析 結(jié)果 顯示，中間體 H 周圍共有 17 個(gè)潛在參與催化的氨基酸殘基，其中 8 個(gè)在兩種酶之間存在差異。通過(guò)定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，研究人員成功實(shí)現(xiàn)了 二者 的功能互換： 在 ShHS 中 引入 E193T 和 L196Y 突變 ， 可使其生成 CbCS 的主要產(chǎn)物 ； 而在 CbCS 中引入相應(yīng)的反向突變 T194E 和 Y197L ， 則能產(chǎn)生 ShHS 的特征 產(chǎn)物。此外，位于活性中心附近的關(guān)鍵位點(diǎn) N76/N81 對(duì)反應(yīng)路徑同樣具有重要調(diào)控作用。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步利用這些突變體，分離鑒定出 hundungol C 、 hundungol D 、 chloroflexotol B 和 hundungene C 等 多種 新型 二萜化合物，并通過(guò)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn) ， 驗(yàn)證了 這些化合物具有 共同的早期環(huán)化過(guò)程 ，以 及后期 的 1,5- 氫遷移機(jī)制。

在論文評(píng)審過(guò)程中，國(guó)際同行專家對(duì)該研究給予了高度評(píng)價(jià)。審稿人指出，在當(dāng)前萜類合酶大規(guī)模挖掘研究不斷涌現(xiàn)的背景下，該工作不僅 是對(duì) 新酶和 新 產(chǎn)物 的羅列 ，更 重要的是 揭示了決定萜類骨架形成的結(jié)構(gòu)與機(jī)理 。 總體而言，該研究通過(guò)整合基因組挖掘、合成生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)與 計(jì)算化學(xué) 等多學(xué)科方法，不僅系統(tǒng)拓展了細(xì)菌二萜天然產(chǎn)物的化學(xué)空間，還揭示了萜類合酶如何通過(guò)活性中心精細(xì)調(diào)控碳正離子級(jí)聯(lián)重排，并實(shí)現(xiàn)不同產(chǎn)物骨架之間的可設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)換 ， 為理解萜類天然產(chǎn)物多樣性的分子基礎(chǔ)提供了關(guān) 鍵線索，也為基于理性設(shè)計(jì)的天然產(chǎn)物生物合成、新型萜類分子定向創(chuàng)制提供了重要的理論與技術(shù)支撐。

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)院定量合成生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合成生物學(xué)研究所 卞光凱 研究 員、華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 徐娟 教授和 波恩大學(xué) Jeroen S. Dickschat 教授為 本文 共同通訊作者 ； 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 / 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng) 博士生 胡哲輝 和 波恩大學(xué)博士 后 Zhiyong Yin 為本文共同第一作者 。 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 為第一完成單位 ?？坡〈髮W(xué) Bernd Goldfuss 教授、南方醫(yī)科大學(xué)羅奇副教授為研究提供重要支持。 感謝深圳合成生物研究重大科技基礎(chǔ)設(shè)施在自動(dòng)化萜類合酶挖掘和功能表征方面提供的支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c02649

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