研究概述

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma，GBM）是一種高度侵襲性的浸潤性惡性腫瘤，目前的治療手段無法完全治愈。因此，需要更精確的分子亞型特征來預(yù)測治療反應(yīng)，以實現(xiàn)個性化的精準(zhǔn)治療。本研究利用識別了癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）中GBM樣本的表達(dá)亞型，并與現(xiàn)有分子亞型進(jìn)行了比較。本研究對GBM進(jìn)行了可重復(fù)且穩(wěn)健的分子亞型分類，這些發(fā)現(xiàn)有助于識別對免疫治療有反應(yīng)的患者，從而改善GBM預(yù)后。

研究方法與結(jié)果

1、新型GBM分子亞型的發(fā)現(xiàn)

在本研究中，作者旨在使用基于BayesNMF的共識聚類方法，在基因組水平上對GBM進(jìn)行新的分子亞型分類。作者的研究結(jié)果表明存在四種新型分子亞型（S1，S2，S3，S4）（圖1A）。為了進(jìn)一步探究這些分子亞型的特性，作者將其與Verhaak等人發(fā)現(xiàn)的亞型（前神經(jīng)元型、神經(jīng)元型、間質(zhì)型、經(jīng)典型）進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：S1中46.2%的樣本為神經(jīng)元亞型；S2中82.8%的樣本為前神經(jīng)元亞型；S3中74%的樣本為間質(zhì)亞型；S4中57.9%的樣本為經(jīng)典型亞型。此外，S2與前神經(jīng)元亞型密切相關(guān)，S3與間質(zhì)亞型密切相關(guān)（70.6%的前神經(jīng)元亞型映射到S2，66.1%的間質(zhì)亞型映射到S3）（圖1B）。這些結(jié)果表明，GBM分型與以往的分型高度一致，每種亞型都與特定的表型相關(guān)。

圖1.四種新型GBM分子亞型

(A)：GBM亞型中標(biāo)記基因表達(dá)的熱圖；(B)：四種新型GBM分子亞型與前神經(jīng)元型、神經(jīng)元型、經(jīng)典型和間質(zhì)型亞型的比較。

2、各亞型生物學(xué)特征與基因組變異

接下來，作者探討了四種分子亞型之間的生物學(xué)意義，并進(jìn)行了ssGSEA分析。結(jié)果表明，S1表現(xiàn)出低增殖特征，S2和S4表現(xiàn)出高增殖特征，S3表現(xiàn)出高免疫特征。在生存趨勢方面，S2和S4的預(yù)后比S1和S3差。此外，作者還發(fā)現(xiàn)S2表現(xiàn)出低免疫和炎癥特征（圖2A）。通過TCGA的泛癌基因組學(xué)特征分析，四種分子亞型顯示出不同的突變譜，其中S3表現(xiàn)出整體更高的非整倍體評分和基質(zhì)分?jǐn)?shù)（圖2B, C）。此外，為了探究這四種亞型與驅(qū)動事件（點突變、插入缺失和拷貝數(shù)變異）的關(guān)聯(lián)，作者分析了癌癥驅(qū)動基因和拷貝數(shù)變異。結(jié)果表明：S2：富集IDH1突變、TP53突變和缺失。S3：富集NF1缺失。S4：富集EGFR擴(kuò)增/突變（圖2D）。

圖2. GBM亞型中的生物學(xué)通路分析和拷貝數(shù)變異分析

3、各亞型的免疫景觀

作者還討論了S1-4亞型的免疫景觀。S2顯示出較低的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)、淋巴細(xì)胞浸潤特征評分、IFN-γ反應(yīng)和TGF-β反應(yīng)。相比之下，S3則表現(xiàn)出更高的上述指標(biāo)（圖3A）。免疫系統(tǒng)中的重要分子，包括免疫檢查點分子和編碼MHC蛋白的人類白細(xì)胞抗原（HLA），在S3中的表達(dá)水平均高于其他三種亞型。根據(jù)泛癌種的免疫特征，S2中濾泡輔助T細(xì)胞、Th2細(xì)胞含量最高，而S3中樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞含量最高（圖3B）。作者還分別評估了四種分子亞型中的免疫評分、基質(zhì)評分，以及與適應(yīng)性免疫和先天免疫相關(guān)的免疫細(xì)胞類型的總體評分，發(fā)現(xiàn)S3中所有四項評分均最高。這些結(jié)果表明S3具有更高的免疫原性，更容易被免疫系統(tǒng)識別并引發(fā)免疫反應(yīng)。

圖3. GBM亞型中的免疫相關(guān)評分和免疫細(xì)胞評分

4、特異性癌癥易感性與基因表達(dá)驗證

首先使用亞型特異性標(biāo)記基因?qū)CLE中的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行分型。由于高級別膠質(zhì)瘤細(xì)胞系數(shù)量較少，最終只映射出三個亞型：S2(n=4)，S3(n=36)，S4(n=6)。作者篩選了本研究中鑒定出的GBM體細(xì)胞拷貝數(shù)變異基因。其中，具有亞型特異性癌癥易感性的基因需滿足兩個條件。最終發(fā)現(xiàn)只有2個基因（CDAN1和UBE2M）符合上述條件。但由于樣本量小，這些基因的差異不顯著。為了驗證CDAN1和UBE2M，作者基于qRT-PCR檢測了這兩個基因在GBM細(xì)胞系U87中的mRNA表達(dá)水平。作者觀察到與正常對照細(xì)胞相比，GBM細(xì)胞中CDAN1和UBE2M的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。這些結(jié)果間接證實了作者所識別的GBM亞型的有效性。

5、蛋白質(zhì)組學(xué)揭示特異性蛋白調(diào)控

為了進(jìn)一步探究四種GBM亞型在蛋白表達(dá)水平上的特征，作者基于S1-4的標(biāo)記基因?qū)PTAC中的GBM樣本聚類為S1 (N=15), S2 (N=18)，S3 (N=35)和S4 (N=21)。與TCGA中的ssGSEA結(jié)果一致，CPTAC中的S2和S4亞型表現(xiàn)出高增殖特征，S3亞型表現(xiàn)出高免疫特征，這也加深了研究者對S3可能是免疫浸潤型的推測（圖4A）。由于S1中沒有顯著激活的通路，后續(xù)研究聚焦于S2、S3和S4中的蛋白調(diào)控。

GISTIC結(jié)果顯示，EGFR和CDKN2A在S2、S3和S4中存在SCNA現(xiàn)象。具體來說，CDKN2A有更多的CNV缺失，而EGFR則有更多的擴(kuò)增（圖4B）。然后作者比較了EGFR和CDKN2A的蛋白豐度，發(fā)現(xiàn)CDKN2A的蛋白豐度在S2和S3中較高，但在S4中較低。EGFR的蛋白豐度在S2和S3中較低，但在S4中較高（圖4C）。基于這些結(jié)果，作者推測S4中CDKN2A的CNV缺失和EGFR的CNV獲得可能是導(dǎo)致CDKN2A表達(dá)降低和EGFR表達(dá)增加的主要原因之一。

圖4. CPTAC GBM中的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

最初的GSVA結(jié)果表明S2和S4亞型具有高增殖特征，S3具有高免疫特征。為了進(jìn)一步研究潛在的生物學(xué)差異，研究者在蛋白質(zhì)組水平上進(jìn)行了更深入的研究。CPTAC隊列中，PD-L1的CNV缺失在S3和S4中更常見，但PD-L1的CNV擴(kuò)增在S2中更常見。研究者還注意到S3中PD-L1的表達(dá)和磷酸化水平最高（圖5A）。在S2-S4中，EGFR的CNV獲得在S4中最高，CNV缺失在S2中最高，S3中則介于兩者之間；并且，S4中觀察到最高水平的EGFR表達(dá)、蛋白豐度和磷酸化（圖5B）。在TCGA隊列中，PD-L1在S2-S4中的CNV現(xiàn)象與EGFR大不相同。S2中PD-L1的CNV率較低，S4中幾乎全是CNV缺失。S4中EGFR的CNV率高于S2和S3，且各亞型的CNV模式均為CNV獲得。S2的PD-L1和EGFR表達(dá)水平最低，S3的PD-L1表達(dá)水平最高，S4的EGFR表達(dá)水平最高（圖5C）?；谙惹暗难芯?，作者比較了S1-4中增殖評分和T細(xì)胞效應(yīng)分子（IFN-γ反應(yīng)）的表達(dá)模式。在S2和S4中觀察到高水平的增殖評分，而在S2中觀察到最低的IFN-γ反應(yīng)評分（圖5D）。S3中也觀察到最高的PRF1、GZMA蛋白豐度（圖5E）。因此，S2、S3和S4在免疫分子的基因組特征上存在異質(zhì)性，這可能導(dǎo)致它們對免疫治療的不同反應(yīng)。

圖5. CPTAC GBM隊列中的基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)分析

6、S3是免疫檢查點治療反應(yīng)的潛在分子亞型

從GEO數(shù)據(jù)庫中檢索到了一個接受免疫治療的GBM測序隊列GSE84010?；跇?biāo)記基因的表達(dá)矩陣，樣本可分為S1、S2、S3和S4。GSEA結(jié)果與TCGA隊列中的樣本特征趨勢一致，S2和S4表現(xiàn)出高增殖特性，S3表現(xiàn)出高免疫特性（圖6A）。與Verhaak等人鑒定的亞型相比，S2中的大多數(shù)病例屬于前神經(jīng)元亞型，S3中的大多數(shù)病例屬于間質(zhì)亞型，S4中的大多數(shù)病例屬于經(jīng)典型亞型（圖6B）。這些結(jié)果與TCGA隊列高度一致，進(jìn)一步表明本研究中GBM的新型亞型是穩(wěn)健的。為了識別對免疫治療有反應(yīng)的亞型，進(jìn)行了TIDE評分分析。由于S1缺乏顯著激活的通路和典型的分子分型特征，作者重點關(guān)注S2、S3和S4的免疫治療反應(yīng)。S4中的樣本TIDE評分最高，表明對免疫治療最不敏感（圖6C）。S4中免疫治療反應(yīng)百分比最低也得到了驗證（圖6D）。相比之下，S3中的TIDE評分較低，表明從免疫治療中獲益更大（圖6C, D）。這些結(jié)果表明S3亞型可能是指示GBM免疫治療反應(yīng)的關(guān)鍵分子亞型。由于S4的免疫治療反應(yīng)率最低，作者在放療/替莫唑胺治療基礎(chǔ)上聯(lián)合貝伐珠單抗治療的GBM隊列（GSE84010數(shù)據(jù)集）中，分析了四種亞型在去除無法分型的樣本后的生存差異。研究者發(fā)現(xiàn)，在貝伐珠單抗組中，S4的預(yù)后明顯優(yōu)于其他三種亞型，而在安慰劑組中，四種亞型的預(yù)后無顯著差異，這表明S4是最適合貝伐珠單抗的亞型。

圖6.免疫治療反應(yīng)預(yù)測

7、識別亞型的生物標(biāo)志物

研究結(jié)果證實了基于BayesNMF的方法構(gòu)建GBM新型亞型分類是可行的。但由于這種分析方法在所有四種亞型中識別出超過400個標(biāo)記基因，模型中的標(biāo)記基因需要壓縮?；赟2、S3和S4中的標(biāo)記基因或標(biāo)記蛋白，作者在TCGA-GBM隊列和RPPA隊列中構(gòu)建了LASSO邏輯回歸模型，通過選擇最小lambda值來選取預(yù)測誤差率最小的模型，以預(yù)測S2、S3和S4亞型。在TCGA-GBM隊列中：包含13個基因的LASSO邏輯回歸模型預(yù)測S2亞型的準(zhǔn)確率達(dá)到96.7%。包含17個基因的模型預(yù)測S3亞型的準(zhǔn)確率達(dá)到86.7%。包含14個基因的模型預(yù)測S4亞型的準(zhǔn)確率達(dá)到93.3%。在RPPA隊列中：包含17個標(biāo)記蛋白的LASSO邏輯回歸模型預(yù)測S2亞型的準(zhǔn)確率達(dá)到84.6%。包含18個標(biāo)記蛋白的模型預(yù)測S4亞型的準(zhǔn)確率達(dá)到84.6%（原文表1）。這些結(jié)果表明，可以使用標(biāo)記基因表達(dá)數(shù)據(jù)或蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確預(yù)測S2、S3和S4亞型。

在本研究中，作者確定了GBM的四種新型分子亞型：S1、S2、S3和S4。S1：以神經(jīng)元和經(jīng)典型亞型為主，代謝活躍但增殖活性非常低。S2：大多數(shù)病例屬于前神經(jīng)元亞型，富集IDH1突變、TP53突變和缺失。S3：大多數(shù)病例屬于間質(zhì)亞型，觀察到樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的高豐度，形成了一個促免疫的活性環(huán)境。S4：大多數(shù)病例屬于經(jīng)典型亞型，檢測到高水平的EGFR表達(dá)和CNV擴(kuò)增，表現(xiàn)出更高的增殖特征。其中，S3是四種亞型中免疫能力最強(qiáng)的亞型，表現(xiàn)出高強(qiáng)度的巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)、淋巴細(xì)胞浸潤特征評分和IFN-γ反應(yīng)。

有趣的是，S1的TIDE評分最低，免疫治療反應(yīng)最高。在研究中，S1沒有顯著激活的生物學(xué)通路，并表現(xiàn)出低增殖特性，這可能解釋了其對免疫治療的高反應(yīng)性。研究存在一些局限性，例如隊列人群主要為白人數(shù)據(jù)、需通過單細(xì)胞測序技術(shù)解析瘤內(nèi)異質(zhì)性等。

總之，該研究報道了一種新的GBM分型，將GBM分為四種亞型，每種亞型都有其特定的分子特征，并對免疫治療表現(xiàn)出不同程度的反應(yīng)率。此外，研究者還為特別重要的亞型量身定制了高精度的預(yù)測模型，為尋找亞型特異性、潛在可靶向的標(biāo)記物提供了參考。

參考文獻(xiàn)：Dongdong, Luo,Aiping, Luo,Su, Hu et al. Genomics and proteomics to determine novel molecular subtypes and predict the response to immunotherapy and the effect of bevacizumab in glioblastoma.[J] .Sci Rep, 2024, 14: 17630.

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