革蘭氏陰性細(xì)菌（Gram?negative bacteria）如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌等，表面包裹著一層額外的外膜（outer membrane, OM），這個(gè)雙層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)不僅能抵御多數(shù)抗生素，還能阻擋人體自然免疫的溶菌酶，為致病和耐藥提供堅(jiān)實(shí)“鎧甲”。這層“外膜”為何穩(wěn)定？它的維護(hù)機(jī)制為何幾十年來成謎？

2025年7月2日，新加坡國立大學(xué)團(tuán)隊(duì)登上《Nature Communications》，揭示了這一古老謎團(tuán)，確定了負(fù)責(zé)維持外膜 (OM) 穩(wěn)定性的重要蛋白質(zhì)復(fù)合物的主要功能。該研究題為“Primary role of the Tol-Pal complex in bacterial outer membrane lipid homeostasis”。

研究背景

革蘭氏陰性菌由外膜 (OM) 定義，OM 有助于包膜完整性和屏障功能。構(gòu)建此雙層膜需要脂多糖、蛋白質(zhì)和磷脂的正確組裝，但這些成分的平衡如何實(shí)現(xiàn)尚不清楚。Tol-Pal 復(fù)合物是一個(gè)長期已知的確保 OM 穩(wěn)定性的系統(tǒng)，它與維持 OM 脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)有關(guān)。然而，由于 Tol-Pal 的隔膜定位及其在分裂過程中的相關(guān)作用，其功能分配一直具有挑戰(zhàn)性。

在這篇研究，作者通過設(shè)計(jì)一個(gè)失去隔膜富集的嵌合復(fù)合物，將Tol-Pal 在 OM 脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的作用與其對(duì)大腸桿菌細(xì)胞分裂的影響分離開來。證明這種位于外周的 Tol-Pal 復(fù)合物完全能夠維持 OM 中的脂質(zhì)平衡，從而恢復(fù) OM 的完整性和屏障。這項(xiàng)工作確定了 Tol-Pal 復(fù)合物在 OM 脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的主要功能，與其在分裂過程中的作用無關(guān)。

實(shí)驗(yàn)方法

巧妙脫鉤，突出脂質(zhì)功能

為明確 Tol–Pal在膜脂質(zhì)調(diào)控方面的獨(dú)立角色，研究人員采用以下方法進(jìn)行了研究：

l基因工程構(gòu)建：將 Tol–Pal 中段插入 TonB TM 片段，制造一個(gè)失去分裂誘導(dǎo)定位但保留脂質(zhì)功能的嵌合體；

l功能驗(yàn)證：采用核糖體標(biāo)簽與免疫熒光技術(shù)驗(yàn)證嵌合體是否仍分布于膜邊緣；

l脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)檢測：通過放射性同位素標(biāo)記磷脂（PG/CL）測定外膜中PL 含量，評(píng)估遺漏后的積累程度；

l通透性評(píng)估：SDS/EDTA敏感實(shí)驗(yàn)、OMV（外膜囊泡）釋放量檢測、RNAse I外漏實(shí)驗(yàn)等評(píng)估膜完整性；

l對(duì)比評(píng)價(jià)：將具有 TonB-TolA 嵌合體菌株與 Δtol-pal（完整缺失）和野生型進(jìn)行多重表型比較。

不僅如此，作者綜合上文細(xì)菌膜系統(tǒng)研究文獻(xiàn)，如Tol–Pal調(diào)控外膜 LPS/PL 結(jié)構(gòu)平衡的早期理論以及 OM 穩(wěn)固多機(jī)制協(xié)同關(guān)系，構(gòu)建了一整套驗(yàn)證系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

脫鉤后仍能穩(wěn)膜，證真脂質(zhì)核心功能

研究人員首先通過構(gòu)建一個(gè)TonBTM-TolA 嵌合蛋白，揭示 TolA 在維持細(xì)菌外膜完整性方面的功能可以脫離細(xì)胞分裂定位而獨(dú)立實(shí)現(xiàn)。

研究者將 TolA 的膜穿越區(qū)替換為 TonB 的跨膜螺旋，使其能夠與 ExbBD 復(fù)合物而非 TolQR 互作。由于 ExbBD-TonB 復(fù)合體不會(huì)定位到分裂位點(diǎn)，這一設(shè)計(jì)使嵌合體失去分裂相關(guān)定位功能，但仍可能保留 TolA 在膜脂穩(wěn)定中的作用。在大腸桿菌 ?tolQRA 缺失菌株中表達(dá) TonBTM-TolA 后，菌株對(duì) SDS/EDTA 和萬古霉素的耐受性顯著增強(qiáng)，表明其外膜屏障功能完全恢復(fù)。相比之下，僅表達(dá)野生型 TolA 的恢復(fù)效果較差。這些結(jié)果明確指出：TolA 的膜穩(wěn)態(tài)作用可獨(dú)立于其分裂定位功能，并依賴其與 ExbBD 的有效互作，揭示 Tol-Pal 復(fù)合體在細(xì)菌外膜脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中的核心作用。

研究發(fā)現(xiàn)，TonBTM-TolA 嵌合蛋白無法定位至細(xì)胞分裂位點(diǎn)，也不能促進(jìn) Pal 在中隔富集，因此無法修復(fù) Tol-Pal 缺失導(dǎo)致的分裂缺陷。熒光顯微顯示，sfGFP-TonBTM-TolA 在細(xì)胞膜周圍均勻分布，而非聚集于中隔。Pal-mCherry在 ?tolQR 背景中未能恢復(fù)中隔定位，進(jìn)一步證實(shí) TolA的分裂功能依賴其定位特性。盡管如此，TonBTM-TolA 能完全恢復(fù)外膜屏障功能，并糾正 tol-pal 缺失導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)異常，提示該嵌合體在周邊定位即可維持外膜脂穩(wěn)態(tài)。

此外，研究表明，雖然 ExbBD-TonBTM-TolA 嵌合體失去中隔定位能力，但其仍能恢復(fù) Tol-Pal 缺失菌株的外膜脂穩(wěn)態(tài)功能。該嵌合體顯著減少外膜囊泡（OMVs）釋放量約79%，并有效降低異常升高的磷脂/脂多糖（PL:LPS）比例與 hepta-acylated LPS 水平，恢復(fù)至接近野生型。說明 Tol-Pal 的主要功能是維持外膜脂穩(wěn)態(tài)與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，而非依賴中隔定位。該發(fā)現(xiàn)有助于明確 Tol-Pal 的功能核心，也為今后操控外膜穩(wěn)態(tài)提供了潛在策略。

總結(jié)

本研究明確Tol-Pal維持外膜脂穩(wěn)態(tài)的功能可獨(dú)立于其細(xì)胞分裂作用，揭示其主要生理職責(zé)在于調(diào)控外膜脂質(zhì)組成與穩(wěn)定性。未來應(yīng)聚焦于Tol-Pal是否通過驅(qū)動(dòng)磷脂回收實(shí)現(xiàn)脂穩(wěn)態(tài)，并探索其在細(xì)胞分裂中調(diào)控膜曲率與內(nèi)陷的潛在機(jī)制。

專家表明，這一突破標(biāo)志著我們對(duì)細(xì)菌外膜組裝和脂質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼w理解取得了重要的概念進(jìn)步，也證明了我們?yōu)殛U明活細(xì)胞基本機(jī)制所做的持續(xù)努力。

https://www.nature.com/articles/s41467-025-57630-y#Sec2

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