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2025年8月29日，中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院李志剛教授在Journal of Neuroinflammation發(fā)表：Circulatory extracellular vesicles transport complement C1q for promoting neuronal amyloid-β production in Alzheimer’s disease，揭示了循環(huán)細(xì)胞外囊泡運(yùn)輸補(bǔ)體C1q以促進(jìn)阿爾茨海默病中的神經(jīng)元淀粉樣β蛋白產(chǎn)生。

阿爾茨海默病（AD）是最常見的癡呆類型。AD的一個(gè)主要病理特征是淀粉樣β蛋白（Aβ）的聚集，這主要由β-分泌酶（BACE1）的活性驅(qū)動(dòng)。然而，導(dǎo)致Aβ持續(xù)積累的機(jī)制尚不清楚。循環(huán)中的細(xì)胞外囊泡（EVs）可能在AD進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。在此，作者研究了AD中的循環(huán)EVs是否促進(jìn)Aβ的生成和聚集。本研究中，發(fā)現(xiàn)與從野生型小鼠（WT）分離的循環(huán)EVs（WTEVs）相比，從APP/PS1小鼠分離的循環(huán)EVs（APPEVs）濃度更高并在神經(jīng)元中激活了JAK2-STAT1通路，上調(diào)了BACE1的表達(dá)和活性。這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)了脂筏中淀粉樣前體蛋白（APP）的β-切割，誘導(dǎo)了大量Aβ的生成。蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示，APPEVs中的補(bǔ)體C1q是激活JAK2-STAT1-BACE1通路的關(guān)鍵蛋白。總之，在AD進(jìn)展過程中，含有補(bǔ)體C1q的循環(huán)EVs被遞送至神經(jīng)元激活其JAK2-STAT1信號(hào)通路。

圖一 APP/PS1小鼠血漿中細(xì)胞外囊泡的濃度升高

作者從6月齡雄性野生型（C57BL/6）和AD模型（APP/PS1）小鼠中分離血漿細(xì)胞外囊泡（EVs），分別命名為WTEVs和APPEVs。免疫熒光證實(shí)APP/PS1小鼠海馬存在Aβ斑塊，符合AD病理特征。采用尺寸排阻色譜結(jié)合超速離心法純化小EVs。蛋白印跡顯示，WTEVs和APPEVs均表達(dá)外泌體標(biāo)志物ALIX、CD9和CD81，且無線粒體污染，電鏡下均呈典型杯狀結(jié)構(gòu)，直徑約100 nm。值得注意的是，APPEVs中ALIX和CD9水平更高，納米流式分析進(jìn)一步證實(shí)其濃度顯著高于WTEVs，而粒徑無差異。結(jié)果表明，該方法可高效分離血漿小EVs，且AD模型小鼠血漿EVs濃度更高。

圖二 APPEVs通過JAK2-STAT1-BACE1信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)元Aβ42的產(chǎn)生

隨后，作者探究了APPEVs是否能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元中Aβ的生成增加。與對照組或WTEVs處理組相比，經(jīng)APPEVs處理的原代神經(jīng)元及其培養(yǎng)上清液中Aβ42的濃度顯著升高。Aβ42的生成源于APP先后被β-分泌酶（BACE1）和γ-分泌酶切割，而由α-分泌酶和γ-分泌酶切割則產(chǎn)生可溶性片段。因此，β-分泌酶的活性決定了Aβ42的病理性生成。對神經(jīng)元BACE1活性的評(píng)估顯示，與WTEVs處理組相比，APPEVs處理后神經(jīng)元中的BACE1活性顯著增加。此外，APPEVs處理組中BACE1蛋白的表達(dá)水平也顯著上調(diào)。為評(píng)估阿爾茨海默病小鼠來源的血漿細(xì)胞外囊泡（APPEVs）是否損傷神經(jīng)元，研究首先檢測乳酸脫氫酶（LDH）釋放，發(fā)現(xiàn)APPEVs未增加LDH釋放，表明其不直接損害神經(jīng)元活力。已知BACE1（β-分泌酶）受JAK2-STAT1通路調(diào)控。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對照組或野生型EVs（WTEVs）處理組相比，APPEVs顯著增強(qiáng)神經(jīng)元中JAK2（Tyr1007/1008）和STAT1（Tyr701）的磷酸化，并促進(jìn)p-STAT1向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位。免疫熒光也顯示APPEVs上調(diào)BACE1表達(dá)及p-JAK2水平。使用JAK2抑制劑XL019或STAT1抑制劑FDB后，APPEVs誘導(dǎo)的BACE1上調(diào)被顯著抑制，證明該效應(yīng)依賴JAK2-STAT1通路。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，APPEVs促進(jìn)APP與BACE1在脂筏（GM1標(biāo)記區(qū)域）中共定位，提示其增強(qiáng)APP的β-切割活性，最終導(dǎo)致Aβ42生成增加。APPEVs雖不直接損傷神經(jīng)元，但通過激活JAK2-STAT1信號(hào)通路上調(diào)BACE1表達(dá)，從而增強(qiáng)Aβ 42的產(chǎn)生，加劇AD相關(guān)病理過程。

圖三 血漿細(xì)胞外囊泡進(jìn)入大腦，且未破壞血腦屏障

為了探究循環(huán)中的細(xì)胞外囊泡是否能夠穿過血腦屏障并進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元Aβ42的生成，作者通過尾靜脈注射的方式向小鼠分別給予PBS、PBS-DiR、WTEVs-DiR和APPEVs-DiR。WTEVs-DiR和APPEVs-DiR均成功進(jìn)入大腦，且兩者之間無顯著差異，表明WTEVs和APPEVs穿越血腦屏障的效率相似。此外，WTEVs-DiR和APPEVs-DiR均可被遞送至肝臟。然而，在腦組織或肝臟組織中均未檢測到PBS-DiR，這表明未與細(xì)胞外囊泡結(jié)合的游離DiR在經(jīng)過尺寸排阻色譜和超速離心處理后無法被回收。此外，作者還探究了血漿細(xì)胞外囊泡進(jìn)入大腦是否會(huì)破壞血腦屏障緊密連接的完整性。與對照組相比，WTEVs或APPEVs處理組中，內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白CLDN1和連接黏附分子JAM-A的表達(dá)水平均未發(fā)生顯著改變。這些結(jié)果表明，WTEVs和APPEVs可以從血液循環(huán)穿過血腦屏障，而不會(huì)破壞其緊密連接的完整性。

圖四 APPEVs通過攜帶C1q促進(jìn)小鼠中Aβ斑塊的形成

由于野生型小鼠不會(huì)形成Aβ斑塊，作者采用APP/PS1小鼠模型來評(píng)估APPEVs對Aβ斑塊形成的影響。為了研究C1q在APPEVs中于早期AD模型中的作用和機(jī)制，每周向14周齡的APP/PS1小鼠靜脈注射一次APPEVs，部分小鼠同時(shí)給予C1q抑制劑持續(xù)至小鼠20周齡。對照組則注射生理鹽水或WTEVs。對腦組織切片進(jìn)行NeuN和BACE1染色分析顯示，與對照組和WTEVs組相比，APPEVs處理組神經(jīng)元中BACE1的熒光表達(dá)顯著增加。C1q抑制劑有效抑制了APPEVs誘導(dǎo)的神經(jīng)元BACE1表達(dá)升高。此外，對腦組織切片進(jìn)行Aβ染色發(fā)現(xiàn)，與對照組和WTEVs組相比，APPEVs顯著增加了Aβ斑塊的數(shù)量和體積。而C1q抑制劑能有效抑制APPEVs引起的Aβ斑塊數(shù)量和體積的增加。為探究BACE1表達(dá)和Aβ斑塊的增加是否與神經(jīng)炎癥或內(nèi)源性C1q上調(diào)有關(guān)，作者提取腦組織裂解液中的總RNA進(jìn)行RT-qPCR檢測。結(jié)果顯示，各處理組（包括WTEVs、APPEVs、單獨(dú)使用C1q抑制劑或APPEVs聯(lián)合C1q抑制劑）中C1qa的mRNA表達(dá)水平均無顯著變化，表明細(xì)胞外囊泡處理并未刺激腦內(nèi)細(xì)胞的內(nèi)源性C1q轉(zhuǎn)錄。此外，多種促炎細(xì)胞因子（包括IL-6、IL-12b、TNF-α和IFN-γ）的表達(dá)水平在各組間也未發(fā)生顯著改變，表明APPEVs未引發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，循環(huán)中的APPEVs通過將C1q運(yùn)送至大腦，誘導(dǎo)神經(jīng)元BACE1表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)Aβ的生成和Aβ斑塊的形成。

總之，本研究強(qiáng)調(diào)了外周循環(huán)EVs在AD早期促進(jìn)Aβ生成中的作用及其機(jī)制。揭示了EVs及其所含C1q在推動(dòng)AD進(jìn)展中的功能并將C1q確定為早期AD藥物研發(fā)的潛在治療靶點(diǎn)。

文章來源

https://doi.org/10.1186/s12974-025-03528-x