基于阻斷置換擴(kuò)增技術(shù)提高傳統(tǒng)Sanger測(cè)序靈敏性在檢測(cè)與輔助診斷華氏巨球蛋白血癥中的應(yīng)用

第一完成人：病理科 顧怡瑾

第二完成人：病理科 王朝夫 董磊

第三完成人：病理科 李醫(yī)民

2024年冬，一位63歲的男性患者因不明原因的雙下肢持續(xù)水腫，在外院未能獲得明確診斷。瑞金醫(yī)院血液科初步檢查發(fā)現(xiàn)其血清中IgM異常升高，超聲提示全身多處淋巴結(jié)腫大，臨床高度懷疑為血液系統(tǒng)腫瘤。在進(jìn)一步的病理評(píng)估中，穿刺組織先經(jīng)基因檢測(cè)確認(rèn)存在MYD88基因L265P突變，進(jìn)一步采用阻斷置換擴(kuò)增改良的Sanger測(cè)序（BDA Sanger）檢測(cè)，檢出CXCR4基因S338X低頻熱點(diǎn)突變。后來經(jīng)數(shù)字PCR法（dPCR）驗(yàn)證，該突變頻率僅為0.46%。最終，借助MYD88基因與CXCR4基因的BDA Sanger檢測(cè)結(jié)果，輔助明確了華氏巨球蛋白血癥（Waldenstr?m macroglobulinemia）的病理診斷，并且為臨床治療提供了關(guān)鍵依據(jù)。

華氏巨球蛋白血癥屬罕見病,其年發(fā)病率約為每百萬人中3-4人。許多患者在早期可能沒有任何癥狀, 只是在體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)血象異?；蜓虻鞍自龈?進(jìn)一步患者會(huì)出現(xiàn)乏力、出血、視力模糊及手腳麻木等癥狀，均源于癌細(xì)胞在骨髓中的增殖和大量名為“IgM”的異常免疫球蛋白在血液中作祟。人體內(nèi)的免疫球蛋白有多種，IgM的個(gè)頭最大，所以才有巨球蛋白的名稱。WM的診斷需要結(jié)合血常規(guī)、血免疫固定電泳、骨髓穿刺活檢以及基因檢測(cè)等多項(xiàng)檢查來綜合判斷，而MYD88和CXCR4基因就是WM診療過程中高度依賴的分子標(biāo)志物。其中，MYD88基因L265P突變幾乎見于95%以上的WM病例，而CXCR4基因突變則更為復(fù)雜——不僅存在多個(gè)熱點(diǎn)（如S338X、R334X），且突變頻率常低于10%，極易被常規(guī)方法漏檢。傳統(tǒng)Sanger測(cè)序法雖成本低廉、操作簡(jiǎn)便，但靈敏度通常僅限于15%–20%的變異等位基因頻率（VAF），如同在昏暗燈光下辨認(rèn)細(xì)小字跡，稍有不慎便會(huì)遺漏關(guān)鍵信息。

數(shù)字PCR法或二代測(cè)序法雖靈敏度高，但要么受限于檢測(cè)試劑不普及，要么因?yàn)橘M(fèi)用高與檢測(cè)流程復(fù)雜，難以廣泛普及。面對(duì)這一臨床痛點(diǎn)，瑞金醫(yī)院病理科聯(lián)合分子診斷團(tuán)隊(duì)，自主設(shè)計(jì)研發(fā)了針對(duì)CXCR4基因的阻斷置換擴(kuò)增（Blocker Displacement Amplification, BDA）技術(shù)，利用特異性阻斷劑“屏蔽”野生型DNA序列擴(kuò)增，使突變序列在PCR過程中獲得優(yōu)先放大，從而將檢測(cè)靈敏度提升至0.2% ——相當(dāng)于在一萬個(gè)正常細(xì)胞中精準(zhǔn)識(shí)別出二十個(gè)攜帶突變的“異類”。

此例患者的傳統(tǒng)Sanger測(cè)序CXCR4基因的檢測(cè)結(jié)果呈陰性，未能解釋患者對(duì)BTK抑制劑治療反應(yīng)不佳的潛在原因。因此，瑞金醫(yī)院病理科針對(duì)這一致病基因探索性的使用了這項(xiàng)創(chuàng)新技術(shù)：BDA Sanger檢測(cè)。通過該方法，團(tuán)隊(duì)成功檢出該患者的CXCR4 S338X位點(diǎn)是一個(gè)低頻突變，經(jīng)數(shù)字PCR法驗(yàn)證，低頻突變的頻率僅為0.46%。這一發(fā)現(xiàn)不僅補(bǔ)全了分子診斷拼圖，更直接指導(dǎo)了后續(xù)個(gè)體化治療策略的制定，成為精準(zhǔn)病理診斷的一次生動(dòng)實(shí)踐。

這項(xiàng)技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)CXCR4基因多位點(diǎn)突變的同步檢測(cè)，還能覆蓋插入、缺失等復(fù)雜變異類型。在方法學(xué)驗(yàn)證中，其準(zhǔn)確率達(dá)100%，對(duì)S338X和R334X的最低檢出限分別為0.2%和0.4%。與傳統(tǒng)Sanger平行對(duì)比，此項(xiàng)新技術(shù)陽性檢出率提升15.7%，顯著減少了假陰性風(fēng)險(xiǎn)。已有相當(dāng)數(shù)量的標(biāo)本利用該技術(shù)完成檢測(cè)，大幅提升了WM及其他相關(guān)淋巴瘤的分子分型精度，同時(shí)將單樣本檢測(cè)成本控制在合理區(qū)間，真正讓精準(zhǔn)診斷“飛入尋常醫(yī)院”。相關(guān)核心技術(shù)已申請(qǐng)國家發(fā)明專利，并在2025年美國分子病理學(xué)會(huì)年會(huì)上引發(fā)國際同行關(guān)注，彰顯中國病理人在前沿診斷技術(shù)上的創(chuàng)新能力。

值得一提的是，這一分子病理層面的突破，正與瑞金醫(yī)院在人工智能時(shí)代的整體戰(zhàn)略布局深度協(xié)同。2025年，瑞金醫(yī)院正式開源了臨床級(jí)多模態(tài)病理大模型RuiPath，覆蓋包括淋巴瘤在內(nèi)的19種常見癌種，構(gòu)建起從宏觀組織形態(tài)到微觀基因變異的全鏈條智能輔助診斷體系。如果說BDA-Sanger技術(shù)是在“顯微鏡下捕捉基因的低語”，那么RuiPath則是在“數(shù)字森林中自動(dòng)標(biāo)記每一棵異常之樹”。醫(yī)生如今可在RuiPath系統(tǒng)中一鍵調(diào)取AI預(yù)判的病灶區(qū)域、組織學(xué)分級(jí)、脈管侵犯等數(shù)十項(xiàng)結(jié)構(gòu)化指標(biāo)，再結(jié)合高敏分子檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)“形態(tài)+分子+臨床”的三維整合診斷。這種“AI Copilot + 精準(zhǔn)分子工具”的雙輪驅(qū)動(dòng)模式，正在重塑現(xiàn)代病理科的工作范式。

作為國家病理質(zhì)控中心的重要成員單位，瑞金醫(yī)院病理科始終以解決臨床真實(shí)問題為導(dǎo)向，既深耕分子診斷的技術(shù)細(xì)節(jié)，也擁抱AI賦能的系統(tǒng)變革。從一個(gè)低頻CXCR4突變的精準(zhǔn)捕獲，到百萬級(jí)數(shù)字切片訓(xùn)練出的通用病理大模型，瑞金正以扎實(shí)的科研轉(zhuǎn)化能力，推動(dòng)中國病理診斷從“經(jīng)驗(yàn)主導(dǎo)”邁向“數(shù)據(jù)與智能驅(qū)動(dòng)”的新紀(jì)元。未來，隨著RuiPath多中心計(jì)劃的推進(jìn)和更多如BDA-Sanger這樣的創(chuàng)新技術(shù)落地，優(yōu)質(zhì)病理資源將不再局限于頂尖三甲，而是通過標(biāo)準(zhǔn)化、智能化的路徑，惠及更廣泛的患者群體——這正是瑞金醫(yī)者“廣博慈愛，追求卓越”精神在數(shù)字時(shí)代的全新詮釋。

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供 稿丨病理科

編 輯丨溫兆琦