2025年11月15日，馬里奧·內(nèi)格里藥理學(xué)研究所IRCCS Caterina Bendotti研究團(tuán)隊(duì)在《Journal of Neuroinflammation》期刊發(fā)表：Loss of C9orf72 impacts the peripheral neuromuscular system via immune dysregulation and accelerates the progression of amyotrophic lateral sclerosis in SOD-1 mutant mice，揭示了C9orf72缺失通過免疫失調(diào)影響外周神經(jīng)肌肉系統(tǒng)并加速SOD1突變小鼠的肌萎縮側(cè)索硬化癥進(jìn)展。

肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，其中神經(jīng)肌肉系統(tǒng)的完整性對(duì)疾病進(jìn)程至關(guān)重要。C9orf72基因突變是ALS最常見的遺傳病因也可導(dǎo)致額顳葉癡呆（FTD），但其在外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，C9orf72在坐骨神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞中表達(dá)，但不在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。C9orf72缺失小鼠雖未出現(xiàn)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失卻表現(xiàn)出坐骨神經(jīng)髓鞘形成不足、軸突分選缺陷及神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）去神經(jīng)支配加重，后者伴隨乙酰膽堿受體γ亞基（AChRγ）表達(dá)升高。此外，C9orf72缺失引發(fā)外周免疫失調(diào)，包括CD8? T細(xì)胞相關(guān)基因上調(diào)和施萬細(xì)胞中MHCI表達(dá)增加。當(dāng)C9orf72缺失與SOD1??3?突變共存時(shí)，小鼠疾病進(jìn)展更快、表型更嚴(yán)重，但脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失程度并未加劇，提示C9orf72在外周通過影響髓鞘、軸突穩(wěn)定性和免疫微環(huán)境加速ALS病理，而非直接導(dǎo)致中樞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡。

圖一 C9orf72在神經(jīng)肌肉系統(tǒng)中的表達(dá)與細(xì)胞分布

首先將C9?/?小鼠與同齡野生型（C9?/?）小鼠在22周齡前進(jìn)行了體重比較。

結(jié)果：

C9?/?小鼠在18至22周齡期間體重顯著高于C9?/?小鼠。然而，在倒置網(wǎng)格上的前肢和后肢抓握耐力以及轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)方面未觀察到差異，表明不存在功能性神經(jīng)肌肉缺陷。與既往研究一致，C9?/?小鼠在22周齡出現(xiàn)脾腫大。使用C9orf72抗體（GTX634482）發(fā)現(xiàn)：C9orf72在運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和施萬細(xì)胞中表達(dá)，但不在星形膠質(zhì)細(xì)胞中；在坐骨神經(jīng)中主要定位于施萬細(xì)胞，在神經(jīng)肌肉接頭處部分與BTX重疊，提示存在于終末施萬細(xì)胞。盡管C9?/?小鼠在mRNA和蛋白水平確認(rèn)缺失C9orf72，其肌纖維仍顯示免疫染色信號(hào)。免疫印跡顯示，脊髓和坐骨神經(jīng)中僅見55 kDa條帶（敲除后消失），而骨骼肌中存在55 kDa和更豐富的25 kDa兩種亞型，提示組織特異性剪接或翻譯后修飾。

圖二 C9orf72缺失導(dǎo)致骨骼肌去神經(jīng)支配，但不引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失

C9orf72缺失不影響腰段脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量，也不改變星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性，然而，與野生型小鼠相比，C9?/?小鼠的骨骼肌中神經(jīng)支配的神經(jīng)肌肉接頭（NMJ）數(shù)量出現(xiàn)部分但顯著的減少，這與脛骨前肌和腓腸肌中乙酰膽堿受體γ亞基（AChRγ）mRNA水平升高一致，該分子是NMJ去神經(jīng)支配的標(biāo)志物。鑒于22周齡C9?/?小鼠在無運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失的情況下已出現(xiàn)明顯的NMJ去神經(jīng)支配，作者進(jìn)一步檢測了其坐骨神經(jīng)的形態(tài)學(xué)和生化特征，并與野生型對(duì)照小鼠進(jìn)行比較。對(duì)成年C9?/?小鼠坐骨神經(jīng)半薄切片的分析未發(fā)現(xiàn)明顯病理改變，包括有髓神經(jīng)纖維密度、軸突變性或髓鞘損傷（如脫髓鞘或慢性再髓鞘化）。然而，電子顯微鏡觀察顯示，與對(duì)照組相比，C9?/?小鼠存在大量髓鞘較薄的神經(jīng)纖維，提示髓鞘形成不足。G比值分析進(jìn)一步證實(shí)了C9?/?小鼠存在髓鞘發(fā)育不良：其G比值顯著高于對(duì)照組，表明髓鞘厚度相對(duì)不足。

圖三 C9orf72缺失損害施萬細(xì)胞的髓鞘形成并在坐骨神經(jīng)中誘導(dǎo)非髓鞘型施萬細(xì)胞活化

接下來，作者通過坐骨神經(jīng)裂解物的Western blot分析，探究C9?/?成年小鼠中觀察到的髓鞘形成不足是否伴隨分子水平的變化。

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結(jié)果：

與野生型小鼠相比，C9?/?小鼠坐骨神經(jīng)中髓鞘堿性蛋白（MBP）和由施萬細(xì)胞產(chǎn)生的髓鞘相關(guān)酶CNPase的蛋白水平顯著降低。與此同時(shí)，非髓鞘型施萬細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的表達(dá)在C9?/?小鼠坐骨神經(jīng)中顯著升高。這一結(jié)果進(jìn)一步得到了免疫組織化學(xué)的支持：C9?/?小鼠坐骨神經(jīng)中GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，提示非髓鞘型施萬細(xì)胞被激活。有趣的是，GFAP在坐骨神經(jīng)中與GAP-43部分共定位。盡管GAP-43也表達(dá)于再生中的軸突，但在此背景下，其表達(dá)可能同時(shí)反映軸突變化以及施萬細(xì)胞前體或非髓鞘型施萬細(xì)胞的存在。因此，雖然將這種共定位視為非髓鞘型施萬細(xì)胞激活的佐證，但也承認(rèn)不能排除損傷或重塑引起的軸突GAP-43表達(dá)。值得注意的是，軸突標(biāo)志物NF200的水平未發(fā)生變化，表明外周軸突并非主要受損部位。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)不僅支持了作者此前通過電鏡觀察到的形態(tài)學(xué)結(jié)果，還從分子層面提供了施萬細(xì)胞群體發(fā)生改變的證據(jù)。

圖四 C9orf72缺失加劇了SOD1G93A小鼠的神經(jīng)肌肉功能障礙和神經(jīng)肌肉接頭去神經(jīng)支配

盡管外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）中髓鞘形成過程的改變并未在C9?/?小鼠中引發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病表型，作者進(jìn)一步探究了C9orf72缺失是否會(huì)影響SOD1G93A小鼠的疾病進(jìn)展和病理特征。將雄性半合子SOD1G93A小鼠與雌性C9?/?小鼠雜交，獲得SOD1G93A/C9?/?雌性后代。盡管SOD1G93AC9?/?與SOD1G93AC9?/?兩組小鼠體重下降程度相似，但SOD1G93AC9?/?小鼠表現(xiàn)出更早的癥狀起始和更快的功能衰退，在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和PaGE測試中均明顯劣于SOD1G93AC9?/?小鼠。

結(jié)果：

SMI31免疫染色顯示，SOD1??3?C9?/?小鼠腰段脊髓腹角中積聚磷酸化神經(jīng)絲的空泡化運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和營養(yǎng)不良軸突呈增多趨勢(shì)；Western blot進(jìn)一步證實(shí)磷酸化神經(jīng)絲/總神經(jīng)絲比值升高，提示殘余運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突運(yùn)輸受損。脛骨前肌中，SOD1??3?C9?/?小鼠的去神經(jīng)支配NMJ比例更高，伴隨AChR-γ表達(dá)進(jìn)一步上升。坐骨神經(jīng)中，軸突應(yīng)激標(biāo)志物NF200和β-importin水平升高，而髓鞘蛋白MBP和CNPase不變；GFAP上調(diào)反而減弱。電鏡顯示C9缺失加劇了軸突空泡化和線粒體異常，表明C9orf72缺失加重SOD1突變所致的神經(jīng)肌肉結(jié)構(gòu)損傷。在脊髓中，SOD1??3?C9?/?小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的膠質(zhì)反應(yīng)（GFAP、IBA1、CD68升高）及T細(xì)胞浸潤（CD4?/CD8?相關(guān)轉(zhuǎn)錄本增加）。但促炎因子（TNFα、IL-1β、CCL2）未進(jìn)一步升高，反而抗炎因子IL-10和修復(fù)相關(guān)基因YM1顯著上調(diào)，提示免疫微環(huán)境向調(diào)節(jié)/修復(fù)表型偏移。

綜上所述，本研究揭示C9orf72在外周神經(jīng)肌肉系統(tǒng)中具有關(guān)鍵保護(hù)作用：其缺失雖不直接殺死運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，卻通過損害施萬細(xì)胞、加劇軸突損傷和NMJ去神經(jīng)支配并改變免疫微環(huán)境，顯著加速ALS進(jìn)展。結(jié)果強(qiáng)調(diào)ALS是多系統(tǒng)疾病，靶向外周和免疫調(diào)控或?yàn)镃9orf72相關(guān)ALS提供新治療策略。

文章來源

https://doi.org/10.1186/s12974-025-03597-y

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