【寫在前面】：本期推薦的是由成都中醫(yī)藥大學(xué)等研究團隊合作近期發(fā)表于Phytomedicine(IF8.3）的一篇文章，揭示通過大鼠實驗證明，藏族藥方二十五味珊瑚丸通過調(diào)節(jié) GRP78/XBP1/CHOP 信號通路減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而緩解腦缺血損傷。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Ershiwuwei Shanhu pills alleviates cerebral ischemia injury in rats by regulating endoplasmic reticulum stress through GRP78/XBP1/CHOP pathway

背景

二十五味珊瑚丸（藏文名：???????????????，簡稱ESWWSHW）是一種用于治療腦缺血的傳統(tǒng)藏藥復(fù)方，主要由25味藥材組成，包括14種植物藥和11種礦物藥。該方劑于公元8世紀(jì)由玉妥·云登貢布創(chuàng)立，后被收錄于藏醫(yī)經(jīng)典《四部醫(yī)典》，并載入《中華人民共和國藥典》（2020年版第一部）。其功效為開竅通絡(luò)、止痛，臨床上主要用于治療“白脈病”（藏醫(yī)病名，涵蓋腦缺血）、神志不清、頭痛、癲癇及各類神經(jīng)性疼痛，然而其抵抗腦缺血損傷的具體分子機制至今仍未明確。

目的

本研究旨在系統(tǒng)闡明二十五味珊瑚丸抗腦缺血損傷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機制，特別是探索其是否通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡途徑來發(fā)揮腦保護作用。

方法

研究首先采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）對二十五味珊瑚丸的化學(xué)成分及其入血成分進行定性分析，同時利用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（HPLC-QqQ-MS）對12批次樣品的27種化學(xué)成分進行定量測定。在動物實驗中，將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平陽性藥組及二十五味珊瑚丸低、中、高劑量組，采用線栓法建立大腦中動脈阻塞（MCAO）腦缺血再灌注模型。藥效學(xué)評價指標(biāo)包括腦梗死比率和神經(jīng)行為學(xué)評分。機制研究方面，綜合運用代謝組學(xué)和蛋白芯片技術(shù)篩選差異代謝物與蛋白，并通過對腦組織（間腦、皮質(zhì)、海馬）進行病理學(xué)檢查、TUNEL染色（檢測凋亡）以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、蛋白質(zhì)印跡（WB）和免疫熒光（IF）等分子生物學(xué)技術(shù)，驗證藥物對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-凋亡通路的影響。

結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)，從二十五味珊瑚丸中定性鑒定出76種化學(xué)成分，其中7種原型成分可入血，49種可分布至各組織（包括腦組織）。藥效實驗證實，該藥能顯著改善MCAO模型大鼠的神經(jīng)行為學(xué)缺損，降低腦梗死率，減輕腦皮層和海馬區(qū)的神經(jīng)元病理損傷，并減少皮層凋亡細胞數(shù)量。機制上，代謝組學(xué)分析鑒定出14個差異代謝物，主要富集于鞘脂代謝和甘油磷脂代謝通路；蛋白芯片篩選出18個差異表達蛋白，網(wǎng)絡(luò)分析提示IL-10、IL-3、IL-7可能是關(guān)鍵靶點。分子生物學(xué)檢測進一步顯示，二十五味珊瑚丸能顯著上調(diào)缺血腦組織中ATF6、XBP1、BCL2的mRNA表達，下調(diào)CHOP、GRP78、BAX、NLRP3的蛋白表達，并上調(diào)XBP1蛋白表達，表明其核心作用與調(diào)控GRP78/XBP1/CHOP這一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路密切相關(guān)。

結(jié)論

本研究表明，二十五味珊瑚丸對腦缺血損傷的保護作用，是通過調(diào)節(jié)鞘脂和甘油磷脂代謝、影響炎癥相關(guān)因子（如IL-10、IL-3、IL-7），并最終通過抑制GRP78/XBP1/CHOP信號通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性細胞凋亡來實現(xiàn)的。該研究從現(xiàn)代科學(xué)角度揭示了這一傳統(tǒng)藏藥復(fù)方治療腦缺血的作用機制。

【前言】

根據(jù)天文歷法指導(dǎo)，藏醫(yī)藥師會依據(jù)時辰服用不同的藏藥制劑，以達到更佳的治療效果。例如，藏醫(yī)治療腦缺血疾病時，常聯(lián)合使用“七十味珍珠丸或二十五味珍珠丸”與“二十五味珊瑚丸或珊瑚七十味丸”。通常，七十味珍珠丸在清晨6時左右服用，二十四味沉香丸在上午8時左右服用，如意珍寶丸在中午12時左右服用，二十味沉香丸則在晚上8時左右服用。根據(jù)患者其他癥狀，還會輔以其他適宜的藏藥制劑。其中，二十五味珊瑚丸具有非常重要的地位。然而，我們課題組已對七十味珍珠丸開展了較多研究（Liang等，2019a，2019b，2023；Xu等，2020），并對二十五味珍珠丸進行了一些研究（Liang，2023a；Liang等，2024；Feng，2024）。盡管二十五味珊瑚丸在臨床上常用于治療腦梗死（Tan，2020；Zhu等，2020），但相關(guān)文獻卻不多見。目前，我們團隊啟動了對二十五味珊瑚丸的研究，旨在不僅闡明其作用機制與活性成分，也為后續(xù)揭示不同藏藥配伍組合的科學(xué)性奠定基礎(chǔ)。

【結(jié)果部分】

1.利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)成功建立了二十五味珊瑚丸（ESWWSHW）及其混合對照品的正、負離子基峰離子流圖，完成了制劑化學(xué)成分的定性分析基礎(chǔ)。

2. 明確了ESWWSHW中76種已鑒定化學(xué)成分的可能裂解途徑，為后續(xù)指認入血入腦成分提供了關(guān)鍵質(zhì)譜信息。

3. 在大鼠腦缺血24小時后，鑒定出7種草藥原型成分入血，49種成分進入各組織（包括5種入腦），提示這些成分可能是其治療缺血性中風(fēng)的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

4. 對12批ESWWSHW中27種化學(xué)成分進行定量分析，發(fā)現(xiàn)藏紅花素和羥基紅花黃色素A的含量普遍較高，而烏頭堿含量較低，且不同廠家的制劑存在成分差異。

5. 發(fā)現(xiàn)ESWWSHW能顯著回調(diào)腦缺血大鼠血漿中14種差異代謝物（如半乳糖神經(jīng)酰胺、1-磷酸鞘氨醇等），這些代謝物主要涉及鞘脂代謝和甘油磷脂代謝兩條關(guān)鍵通路。

6.篩選出18個差異表達蛋白，并通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析確定IL-10、IL-3和IL-7可能是ESWWSHW干預(yù)腦缺血損傷的關(guān)鍵炎癥相關(guān)靶點。

7. 藥效學(xué)實驗證實，ESWWSHW能劑量依賴性地顯著降低腦缺血再灌注模型大鼠的腦梗死率。

8.ESWWSHW能改善腦缺血皮層神經(jīng)元的變性壞死，增加尼氏體數(shù)量，并顯著抑制皮層細胞的凋亡。

9.在分子層面證實，ESWWSHW能上調(diào)腦組織中ATF6、XBP1、BCL2的mRNA表達，同時下調(diào)CHOP、GRP78、BAX、NLRP3的蛋白表達，并上調(diào)XBP1蛋白表達。

10.ESWWSHW通過調(diào)節(jié)GRP78/XBP1/CHOP信號通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡，是其發(fā)揮腦缺血保護作用的核心機制。

【結(jié)論與討論】

綜上所述，本研究的結(jié)論與討論部分綜合表明，二十五味珊瑚丸（ESWWSHW）通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用，對腦缺血再灌注損傷發(fā)揮保護作用。具體而言，研究首先通過UPLC-Q-TOF-MS和HPLC-QQQ-MS技術(shù)系統(tǒng)鑒定了ESWWSHW中的76種化學(xué)成分，并定量分析了12批次制劑中27種成分的含量，確認藏紅花素和羥基紅花黃色素A為主要成分；體內(nèi)分析進一步揭示，在腦缺血模型大鼠中，有7種原型成分入血，49種成分進入各組織（包括5種入腦成分），提示這些成分可能是其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。藥效學(xué)實驗證明ESWWSHW能顯著改善神經(jīng)行為評分、降低腦梗死率、減輕腦組織病理損傷并抑制細胞凋亡。機制研究發(fā)現(xiàn)，ESWWSHW能調(diào)節(jié)血漿中與鞘脂代謝和甘油磷脂代謝相關(guān)的14種差異代謝物，并通過蛋白芯片技術(shù)篩選出18個差異表達蛋白，其中IL-10、IL-3和IL-7被識別為關(guān)鍵炎癥靶點；進一步的分子生物學(xué)驗證表明，ESWWSHW通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）介導(dǎo)的GRP78/XBP1/CHOP信號通路，上調(diào)ATF6、XBP1、BCL2等抗凋亡因子表達，同時下調(diào)CHOP、GRP78、BAX、NLRP3等促凋亡與促炎蛋白表達，從而抑制細胞凋亡與炎癥反應(yīng)，緩解腦缺血損傷。盡管研究存在一些局限性（如僅采用LC-MS分析非揮發(fā)性成分），但仍為ESWWSHW治療腦缺血提供了系統(tǒng)的化學(xué)與藥理學(xué)依據(jù)，并為其后續(xù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、藥代動力學(xué)及深入機制研究奠定了基礎(chǔ)。

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