作者：閔

腫瘤基因檢測的點(diǎn)突變、擴(kuò)增以及融合等突變類型與我們的治療息息相關(guān)，如EGFR基因的點(diǎn)突變、ALK基因融合突變等等。除了這些突變類型以外，還有另一種突變形式名為“甲基化”，它們很少出現(xiàn)在廣大病友的視線里，但卻與癌癥發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。甲基化檢測相比其他腫瘤基因相關(guān)檢測有些“默默無聞”，今天就給大家介紹一下這個(gè)小透明，順便聊聊它們的優(yōu)勢與缺陷。

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什么是DNA甲基化？

DNA甲基化是基因表觀修飾的方式之一，可以調(diào)控基因表達(dá)的時(shí)機(jī)及表達(dá)的量度，具有十分重要的生物意義?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，包括腫瘤、糖尿病以及自身免疫性疾病等等?，F(xiàn)有研究表明多種癌癥的發(fā)生發(fā)展與DNA甲基化有關(guān)。甲基化通常抑制基因表達(dá)，比如在腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因CpG島（C為胞嘧啶，G為鳥嘌呤，二者會在DNA部分區(qū)域高度聚集，類似海中的小島，故稱為“CpG島”）中的CpG呈高度甲基化會使得抑癌基因表達(dá)下降，這就給了癌癥可乘之機(jī)。

以上是DNA甲基化的生物學(xué)作用，它在分子層面的本質(zhì)是指在DNA甲基化酶的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，并將甲基團(tuán)選擇性添加到胞嘧啶上形成5’-胞嘧啶的過程。

打個(gè)比方，這就像是給胞嘧啶戴上了一頂名為“甲基”的帽子，讓原本認(rèn)識它的工友不認(rèn)識他了，使得他的工作不易開展。

DNA甲基化通常發(fā)生在CpG或者CpHpG密集的點(diǎn)位，這類成簇的CpG島大多在基因的啟動子區(qū)域。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類60%的基因啟動子會含有此類CpG島，半數(shù)以上的編碼基因與CpG島有關(guān)。

圖片來源：包圖網(wǎng)

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DNA甲基化的檢測方式

DNA甲基化可使用PCR、NGS以及質(zhì)譜等方式檢測。與各位熟悉的腫瘤基因檢測不同的是，甲基化檢測最常選用的檢測方式為PCR。

PCR技術(shù)簡便、高效、快速、可重復(fù)的特點(diǎn)對于甲基化檢測是重要的優(yōu)勢。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路的不同，甲基化檢測的PCR技術(shù)還可以細(xì)分為甲基化特異性PCR、甲基化特異性的高分辨率溶解曲線法以及數(shù)字PCR法，三者間各有側(cè)重點(diǎn)。

NGS高通量的特點(diǎn)在此并不占很大優(yōu)勢，相反其操作繁瑣、技術(shù)復(fù)雜的特點(diǎn)在甲基化檢測中成為了劣勢。

除了這二者以外，還有一項(xiàng)各位不太熟悉的檢測技術(shù)可用于甲基化的檢測，那就是質(zhì)譜技術(shù)。核酸質(zhì)譜平臺可以同時(shí)檢測數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)DNA甲基化標(biāo)志物，檢測通量適中，質(zhì)譜還可以獲得最大500bp范圍之內(nèi)全部連續(xù)的CpG位點(diǎn)的甲基化定量水平信息。質(zhì)譜有時(shí)受到遺傳多態(tài)性的DNA序列干擾，降低酶切片段質(zhì)量從而影響定量分析結(jié)果。

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DNA甲基化檢測有何用處，是否靠譜？

前文介紹了DNA甲基化的生物學(xué)功能及檢測方式，該項(xiàng)技術(shù)在臨床及市場化應(yīng)用主要集中在癌癥早期篩查領(lǐng)域。近年來甲基化檢測的早篩產(chǎn)品層出不窮，篇幅限制不一一介紹，筆者選取一款較為經(jīng)典且個(gè)人比較熟悉的甲基化檢測項(xiàng)目作為代表，向大家簡單介紹這類檢測的具體用途。

Septin9甲基化檢測應(yīng)該是國內(nèi)最早投入使用的甲基化標(biāo)志物，它起初主要用于腸道腫瘤的早期篩查。Septin家族是一個(gè)廣泛存在于除植物以外的絕大多數(shù)真核生物中的基因家族，它們參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)的分泌和運(yùn)輸，具有十分重要的生物學(xué)功能。Septin9屬于SEPT3亞家族，Septin9甲基化與腸癌的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，其在腸癌的各個(gè)階段（I-IV期）均有檢出且隨著分期越靠后其檢出率越高。由于Septin9甲基化檢測的定位是早期篩查，因此它采用血液作為常規(guī)樣本，與我們熟悉的腫瘤基因檢測有所不同。2011年，德國一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)I期腸癌患者中約有71%的患者檢測到Septin9甲基化，III期及IV期患者檢出率逼近100%[1]。

圖片來源：作者提供

同一研究中，德國學(xué)者納入了50名未經(jīng)治療的結(jié)直腸癌患者以及94名健康人群作為對照，并定義靈敏度為X/50及特異性為（1-X/94）。靈敏度體現(xiàn)了該檢測篩查并發(fā)現(xiàn)潛在腸癌患者的能力，而特異性體現(xiàn)了該檢測誤診健康人群的概率（特異性越高越不易受其他因素干擾）。最終該研究發(fā)現(xiàn)Septin9甲基化檢測的靈敏度達(dá)90.0%，特異性則為88.3%。

2014年我國曾有過一版《中國早期結(jié)直腸癌篩查及內(nèi)鏡診治指南》（后簡稱指南），該指南就納入了Septin9甲基化檢測，與糞便潛血實(shí)驗(yàn)并列作為低危人群初篩的手段[2]。

自Septin9甲基化檢測在國內(nèi)成功獲得注冊證及相關(guān)指南認(rèn)可后，DNA甲基化檢測項(xiàng)目如雨后春筍般不斷出現(xiàn)，至今已獲得我國NMPA批準(zhǔn)的相關(guān)試劑盒多達(dá)數(shù)十種，這里就不按具體試劑盒列舉，只標(biāo)注有哪些DNA甲基化檢測項(xiàng)目，以供各位了解。

除了上表中已拿證產(chǎn)品，還有諸如UriMee等與專家合作研發(fā)的LDT檢驗(yàn)項(xiàng)目，DNA甲基化檢測項(xiàng)目的數(shù)量遠(yuǎn)比這些要多。

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DNA甲基化檢測仍有缺陷？

我們?nèi)砸許eptin9甲基化檢測為例，盡管它已被納入相關(guān)篩查指南，但始終沒有在全國廣泛應(yīng)用，受到幾點(diǎn)關(guān)鍵缺陷制約。

雖然它在德國的研究中展現(xiàn)出不俗的靈敏度與特異性，但經(jīng)其他多項(xiàng)研究后驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)這兩項(xiàng)數(shù)據(jù)并不穩(wěn)定。2016年一項(xiàng)匯總研究綜合14項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Septin9甲基化檢測整體靈敏度僅60%，特異性為91%。靈敏度如此大的波動可能受患者數(shù)量、檢測技術(shù)、乃至檢測基因單一等因素限制，好在特異性表現(xiàn)還算穩(wěn)定[3]。

Septin9甲基化檢測對標(biāo)的是糞便潛血實(shí)驗(yàn)（iFOBT），后者是當(dāng)下腸癌篩查常用的方式之一，但苦于靈敏度偏低且特異性也不理想，易受腸道潰瘍、炎癥甚至痔瘡等多種肛腸疾病干擾。鑒于糞便潛血的篩查性能有限，臨床上也需要其他方式來更好的篩查出潛在的腸癌患者以便及時(shí)治療。

臺灣的一項(xiàng)研究對比了iFOBT與Septin9甲基化檢測的性能，結(jié)果Septin9甲基化檢測的靈敏度為61.8%，特異性為89.6%，而iFOBT這二項(xiàng)數(shù)據(jù)分別為61.4%與70.3%，二者相結(jié)合可將靈敏度提升至84.1%[4]。以往也有研究綜合三個(gè)類似對比試驗(yàn)，其得到的結(jié)論也與臺灣的研究相近，尷尬表明Septin9甲基化檢測的性能僅略優(yōu)于iFOBT。

如上所示，Septin9甲基化檢測的檢測性能對比iFOBT這種基本篩查方式提升有限，達(dá)不到替代病理的程度，二者陽性皆需做腸鏡復(fù)核確認(rèn)，加之其檢查費(fèi)用又高出許多（Septin9甲基化曾在江蘇省定價(jià)1000元/次，相較之下糞便潛血僅六七十元），種種原因相加致使它的推廣受阻。其余DNA甲基化檢測多少與之類似，難免有些食之無味、棄之可惜，這才讓整個(gè)甲基化篩查領(lǐng)域受冷。

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展望

DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是完善腫瘤早期篩查，實(shí)現(xiàn)早診早治理念的有效工具，但仍有需要改進(jìn)的地方?，F(xiàn)在的甲基化檢測正在向多基因聯(lián)合檢測的方向發(fā)展，想必可進(jìn)一步提升靈敏度與特異性，然而另一方面也需要與實(shí)際應(yīng)用結(jié)合，成為老百姓真正能用得起用得上的防癌好幫手。

參考文獻(xiàn)

[1].Warren J D, Xiong W, Bunker A M, et al. Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer[J]. BMC medicine, 2011, 9(1): 133.

[2].柏愚, 楊帆, 馬丹, 等. 中國早期結(jié)直腸癌篩查及內(nèi)鏡診治指南 (2014 年, 北京)[J]. 胃腸病學(xué), 2015, 20(6): 345-365.

[3].Yan S, Liu Z, Yu S, et al. Diagnostic value of methylated septin9 for colorectal cancer screening: a meta-analysis[J]. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research, 2016, 22: 3409.

[4].Xie L, Jiang X, Li Q, et al. Diagnostic value of methylated Septin9 for colorectal cancer detection[J]. Frontiers in oncology, 2018, 8: 247.

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