基于 CRISPR/Cas9 的全基因組系統(tǒng)性基因擾動篩選，使研究者能夠在更廣闊的尺度和更高的分辨率下解析基因功能 ， 給 功能基因組學研究帶來了深刻變革。 目前廣泛應用的 Pooled-CRISPR 篩選，通過將靶向特定基因或全基因組的 sgRNA 文庫導入細胞，構(gòu)建包含大量不同基因突變的細胞群體。隨后，研究者可以基于細胞存活率、增殖速度、藥物敏感性以及流式細胞分選結(jié)合熒光報告基因等易于量化的表型變化，對具有特定表型的細胞群體進行富集和篩選，從而鑒定出調(diào)控 相關(guān) 表型的關(guān)鍵基因【1,2】。

盡管這類 Pooled-CRISPR 篩選方法在高通量、成本效益和實驗可擴展性方面具有顯著優(yōu)勢，但其在解析更 加 復雜 和 精細的細胞特征方面仍然受到限制。例如，與細胞器形態(tài)變化、亞細胞蛋白定位、細胞骨架動態(tài)重塑等需要通過顯微鏡觀察分析的表型相關(guān)的基因，常常難以通過傳統(tǒng)的 Pooled-CRISPR 篩選直接捕獲。將 Pooled-CRISPR 篩選與顯微成像技術(shù)相結(jié)合在實驗設計、數(shù)據(jù)分析、成像通量等方面都面臨顯著挑戰(zhàn)。如何在保持大規(guī)模篩選能力的同時，提高成像解析度和表型分類能力，是當前 CRISPR 功能基因組學向更深層次拓展時亟需解決的問題。

針對上述局限， 近日， 耶魯大學David Breslow團隊 （ 第一作者為孫京波 ） 在Developmental Cell上發(fā)表了文章A microscopy-based CRISPR screening platform enables organellar functional genomics and illuminates ciliary biology，開發(fā)了一種新型篩選平臺，將pooled-CRISPR 基因擾動與熒光顯微鏡表型分析相結(jié)合。該平臺利用商業(yè)化的顯微鏡硬件與軟件與基于定向光激活mCherry蛋白的pooled-CRISPR篩選策略相結(jié)合，通過對呈現(xiàn)特定表型的突變體細胞進行光激活，使其能夠借助流式細胞儀（FACS）實現(xiàn)高效分選（圖1）。這一策略不僅實現(xiàn)了對復雜顯微表型的可擴展篩選，也避免了對光學或編程方面的專業(yè)背景依賴，使平臺具備良好的可及性。 為了進一步提升實驗靈活性并拓寬可篩選表型的范圍，該團隊建立了兩種互補的工作模式：（ 1 ）通過在活細胞中進行遺傳篩選，可對細胞內(nèi)動態(tài)過程進行時空分辨分析；（ 2 ）在固定細胞中結(jié)合抗體免疫標記進行篩選，從而拓展其在多種細胞結(jié)構(gòu)和分子標志物中的適用性。這一設計使得平臺兼容活細胞及固定細胞分析，并能夠處理多種類型的細胞特征 。

基于這一自動化、高通量且可擴展的篩選 平臺 ，該團隊成功開展了全基因組和靶向性篩選，鑒定出多種已知及全新的纖毛調(diào)控因子【3】。進一步，通過整合平行篩選結(jié)果，構(gòu)建了多維度的功能特征圖譜， 實現(xiàn)了對基因功能的精確映射 。通過對篩選獲得的候選基因 的 深入研究，該團隊鑒定了調(diào)控纖毛 G 蛋白偶聯(lián)受體（ GPCR ）功能的關(guān)鍵因 子 EMC 復合體 ，該復合體 能夠特異性調(diào)控纖毛 GPCR (HTR6) 的定位，而不影響纖毛發(fā)生 （ ciliogenesis ） ，這一功能在 EMC5 和 EMC6 敲除細胞中得到了驗證； 并 確認了二吡啶酰胺化賴氨酸（ diphthamide ）生物合成通路在纖毛解體中的作用 。同時該團隊還鑒定出 一種位于纖毛過渡區(qū)（transition zone, TZ）、對纖毛發(fā)生至關(guān)重要且具有進化保守性的微 型 蛋白SMIM27 ， 進一步的研究表明， SMIM27/ TZMP1 定位于纖毛過渡區(qū)（ transition zone ），并且 SMIM27/TZMP1 對人 體 細胞的纖毛形成及非洲爪蟾 （ Xenopus ） 胚胎纖毛功能的正常發(fā)揮均必不可少。

總體而言，該論文提供了一個功能強大、可廣泛應用的技術(shù)與概念框架，證明基于顯微鏡的CRISPR篩選能夠系統(tǒng)性地將基因與細胞器表型關(guān)聯(lián)，并揭示新的生物學功能(圖2)【4】。 這些發(fā)現(xiàn)不僅深化了我們對纖毛結(jié)構(gòu)與功能調(diào)控機制的理解，也為纖毛疾病的治療提供了新的潛在解決途徑。

https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(25)00666-5

制版人： 十一

參考文獻

1 Schraivogel, D., Steinmetz, L. M. & Parts, L. Pooled genome-scale CRISPR screens in single cells.

2 Shalem, O., Sanjana, N. E. & Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR–Cas9.Nature Reviews Genetics16, 299-311 (2015).

3 Breslow, D. K. et al. A CRISPR-based screen for Hedgehog signaling provides insights into ciliary function and ciliopathies.Nat Genet50, 460-471 (2018).

4 Sun, J., Ati?, I. S., Empke, S. L., Khokha, M. K. & Breslow, D. K. A microscopy-based CRISPR screening platform enables organellar functional genomics and illuminates ciliary biology.Dev. Cell(2025).

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