信號肽肽酶（SPP）是目前唯一尚未獲得結構表征的膜內蛋白酶家族。

2025年12月17日，清華大學周瑞和西湖大學施一公共同通訊在PNAS在線發(fā)表題為“Structural insights into human signal peptide peptidase”的研究論文。該研究報道了人源SPPL2a在兩種功能狀態(tài)下的冷凍電鏡結構：無配體狀態(tài)及抑制劑結合狀態(tài)，平均分辨率分別為3.3 ?和3.6 ?。SPPL2a包含九個跨膜螺旋，其折疊方式在SPP家族和早老素家族中高度保守。

在無配體狀態(tài)下，活性位點附近已形成一個反平行β-發(fā)夾結構，這與底物結合狀態(tài)下的早老素1（PS1）結構特征相似。小分子抑制劑L685,458的結合進一步誘導了SPPL2a的構象重排。結合化合物E結合的PS1冷凍電鏡結構，本研究揭示了天冬氨酸膜內蛋白酶對選擇性抑制劑的識別機制及其底物門控機制。基于結構的序列分析揭示了SPP家族與早老素家族之間的關鍵差異，這些差異決定了它們的功能與組裝方式。

受調控的膜內蛋白水解（RIP）是一種普遍存在且進化上保守的信號傳導機制。該過程需要膜內切割蛋白酶（i-CLiPs）的參與，這類酶能夠水解位于膜磷脂雙分子層內的底物肽鍵。根據催化機制，i-CLiPs可分為四類：位點-2金屬蛋白酶、菱形樣絲氨酸蛋白酶、Rce1型谷氨酰蛋白酶以及天冬氨酸蛋白酶，后者包括早老素（PS）家族和信號肽肽酶（SPP）家族。

真核生物的SPP蛋白主要切割II型膜相關信號肽，該切割發(fā)生于信號肽酶完成初始切割之后。人類SPP/SPPL家族包含五個成員：SPP、SPPL2a、SPPL2b、SPPL2c和SPPL3。所有五個成員均具有相似的拓撲結構，其特征為九個跨膜結構域以及保守的ΦD/GxGD和PAL基序，但在分子大小、亞細胞定位、組織表達譜和特異性底物方面存在差異。因此，這些蛋白在眾多細胞過程中發(fā)揮著多樣且關鍵的作用，例如免疫監(jiān)視、內質網相關降解（ERAD）、糖基化調控以及病毒蛋白成熟。在植物中，SPP對于花粉發(fā)育至關重要。

SPPL2a主要定位于溶酶體和晚期內吞體。小鼠中SPPL2a的缺失會損害脾臟B細胞成熟并減少樹突狀細胞數量。人類SPPL2a缺失會導致孟德爾易感性分枝桿菌病，這主要歸因于樹突狀細胞亞群cDC2的缺失。SPPL2A基因座的遺傳多態(tài)性與阿爾茨海默?。ˋD）風險相關，SPPL2A已被提議為AD的致病基因。具體而言，髓系特異性增強子中的突變與SPPL2A表達降低和AD易感性增加相關；而SPPL2A的一個內含子變異則與AD風險降低相關。SPPL2a還可能通過切割吞噬性受體Dectin-1參與AD的發(fā)病機制。

SPPL2a介導底物門控與切割的作用模型（圖片源自PNAS）

SPPL2a的其他已報道底物包括CD74、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和TMEM106B。底物在腔內側發(fā)生脫落切割后，殘留在膜內的N端片段（NTF）會被SPPL2a進一步修剪。釋放的胞內結構域（ICD）進入細胞核并調控基因轉錄。例如，CD74-NTF的ICD調控細胞因子巨噬細胞遷移抑制因子，而TNFα-NTF的ICD則促進白細胞介素-12的表達。TMEM106B調控溶酶體形態(tài)，可能介導不依賴于ACE-2的SARS-CoV-2病毒入侵，并且是額顳葉變性（FTLD）的一個風險因子。經過蛋白水解切割后，TMEM106B產生的片段會在FTLD患者大腦中聚集成淀粉樣蛋白絲。

真核生物SPP家族，包括SPP和SPP樣蛋白（SPPLs），其膜拓撲結構與γ-分泌酶的催化組分早老素相反。值得注意的是，某些細菌如枯草芽孢桿菌含有一種稱為SppA的蛋白酶。盡管名稱相似，SppA與真核生物SPP差異巨大。SppA是一種絲氨酸蛋白酶，僅含單個跨膜片段，其催化性Ser-Lys二元體位于親水環(huán)境中。相比之下，早老素和真核生物SPP均具有九個跨膜螺旋，并在疏水的磷脂雙分子層內介導切割。系統發(fā)育分析顯示早老素和SPP在真核生物中是保守的。與作為獨立酶發(fā)揮功能的SPP不同，早老素是γ-分泌酶的催化組分，該復合物還包含另外三個亞基：尼克司特林（NCT）、PEN-2和APH-1。

詳細的結構信息對于從機制上理解SPP家族功能至關重要。然而，與多種i-CLiPs在結構研究上取得的進展相比，目前僅有SPP家族的低分辨率冷凍電鏡圖像可用。值得注意的是，SPP家族成員可被γ-分泌酶抑制劑（GSIs）靶向抑制，例如過渡態(tài)類似物抑制劑L685,458；這些GSIs在抑制丙型肝炎病毒和腫瘤方面顯示出潛力。靶向γ-分泌酶的小分子已在抗AD或抗癌臨床試驗中得到廣泛測試。脫靶抑制可能在臨床應用中引發(fā)副作用。

在本研究中，作者分別以3.3 ?和3.6 ?的分辨率解析了人源SPPL2a在無配體狀態(tài)及與L685,458結合狀態(tài)下的冷凍電鏡結構。作者還描述了人源γ-分泌酶與化合物E（一種對γ-分泌酶選擇性高于SPPL2a的擬肽抑制劑）結合的結構。這些進展填補了i-CLiPs機制理解上的一個重要空白。

https://doi.org/10.1073/pnas.2528340122