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前言

是否曾苦惱于熒光標記太多，信號相互干擾？是否想觀測細胞內(nèi)的動態(tài)變化，卻怕錯過關(guān)鍵瞬間？今天，就帶大家認識能解決這些難題的科研利器—激光共聚焦顯微鏡。

激光共聚焦顯微鏡（CLSM）憑借其光學(xué)切片、高信噪比、多通道熒光成像的核心優(yōu)勢，成為了連接分子事件與組織結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵橋梁，傳統(tǒng)顯微鏡像一盞大燈，照亮整個房間，所有細節(jié)（無論清晰還是模糊）都混在一起。而共聚焦則使用極細的激光束作為“探針”，在樣本上一個點一個點地進行掃描。其應(yīng)用已從基礎(chǔ)生命科學(xué)研究延伸至臨床診斷、藥物開發(fā)和材料設(shè)計，是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)實驗室的"標準配置"之一。

本文系統(tǒng)介紹了激光共聚焦顯微鏡（我院配備leika激光共聚焦顯微鏡stellaris 5）的基本原理、主要應(yīng)用及優(yōu)勢，為相關(guān)科研工作提供理論支持與實踐指導(dǎo)。

一、激光共聚焦成像原理--為何看得如此清晰？

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“光學(xué)切片”的秘密：點掃描與智能針孔

激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM）的成像原理基于點掃描照明與空間濾波的協(xié)同作用，核心是通過針孔（Pinhole）實現(xiàn)“光學(xué)切片”。激光通過照明針孔形成點光源，經(jīng)掃描振鏡驅(qū)動物鏡在樣本焦平面上逐點掃描，激發(fā)的熒光信號經(jīng)同一物鏡收集后，僅焦平面發(fā)出的光線能恰好聚焦通過位于共軛像平面的探測針孔進入探測器，而焦平面外的雜散光因離焦被針孔阻擋剔除。

簡單地說，這個針孔扮演著 “智能安檢門” 的角色：只有從細胞焦平面（我們想看的那一層）發(fā)出的清晰熒光信號，才能“對號入座”順利通過。而那些來自上下層的模糊雜散光，則會被無情地阻擋在外。

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從2D到3D：構(gòu)建細胞的“高清立體地圖”

這個過程被稱為 “光學(xué)切片” ——我們無需物理切片，就能在無損條件下，逐層獲取樣本內(nèi)部高對比度的二維圖像。通過精密控制載物臺或物鏡，沿Z軸方向進行逐層掃描，并將獲取的一系列“光學(xué)切片”圖像傳輸至計算機，即可通過專業(yè)軟件進行三維重建。最終，我們能夠獲得樣本的高分辨率三維立體圖像，如同繪制出一幅詳盡無誤的 “細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)地圖” ，為觀察亞細胞器分布、細胞間相互作用等提供前所未有的視角。

二、硬件突破—STELLARIS 5的“超強感知系統(tǒng)”（激光光源與檢測器）

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激光光源：“全能光譜調(diào)色臺”白激光（WLL）

想象一下，您要觀察一個用多種顏色熒光筆標記的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，但手頭只有幾支固定顏色的手電筒，總會有些顏色照不亮或看不清。這就是傳統(tǒng)固定激光器的窘境。而我中心STELLARIS 5搭載的 “二代白激光（WLL）” ，則像一臺 “全能光譜調(diào)色臺” 。它實現(xiàn)了三大突破：

?光譜自由：在485-790 nm范圍內(nèi)實現(xiàn)1 nm精度的連續(xù)可調(diào)，幾乎覆蓋所有商用熒光探針的最佳激發(fā)峰。

?多線并行：支持最多8條完全獨立的激光譜線同時激發(fā)，配合AOBS聲光分束技術(shù)，可在單張圖像中采集更多色彩通道

?靈活組合：完美兼容傳統(tǒng)405 nm固態(tài)激光器，實現(xiàn)從紫外到近紅外的全光譜覆蓋。

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信號檢測：“明察秋毫”的PowerHyD S檢測器

強大的光源需要同樣敏銳的“眼睛”來捕捉信號。PowerHyD S檢測器是STELLARIS 5的核心，它采用硅基多像素光子計數(shù)器（MPPC）技術(shù)，通過雪崩二極管和多單元架構(gòu)有效抑制暗噪聲，顯著提高光子采集效率。

其出色的多功能性體現(xiàn)在雙模式自由切換：

?光子計數(shù)模式：能夠以極高還原度分辨和計數(shù)每一個光子，產(chǎn)出高信噪比、適用于定量分析的精確定量數(shù)據(jù)。

?模擬檢測模式：隨時間整合熒光信號，生成動態(tài)范圍更廣、層次更豐富的清晰圖像，尤其適合亮度差異大的樣本。

這意味著，無論是極微弱的熒光信號還是強烈的標記，PowerHyD S檢測器都能清晰、準確地捕獲，確保成像質(zhì)量始終出色。

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應(yīng)用案例：活細胞動態(tài)成像：捕捉生命的瞬間

使用傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡對同一樣本中的多個不同熒光標記成像時，通常需要對每個顏色通道進行時間序列成像，以避免光譜串色導(dǎo)致圖像質(zhì)量下降。在動力學(xué)實驗中，這意味著您可能會錯過快速的動態(tài)事件，因為采集每個時間點所花費的時間會增加。此外，樣本會在載物臺上停留更長時間，因而更難以在整個實驗期間保持細胞健康。下圖采集自使用4種不同的熒光團標記細胞核、肌動蛋白、微管蛋白和質(zhì)膜的活HeLa細胞。STELLARIS可以一次采集全部4個通道，而不必分四次對細胞成像。

例如以下圖像真實記錄了一個COS-7細胞分裂的三個瞬間：中期、后期和末期。染色體如何排列、紡錘絲怎樣牽引、高爾基體與線粒體如何協(xié)作——甚至肌動蛋白皮層的動態(tài)變化，都被清晰捕捉。要真正理解像癌癥這樣的復(fù)雜疾病，我們必須同時觀察多個生物指標在同一個細胞內(nèi)的“對話”。而這需要突破性的成像技術(shù)。STELLARIS 5顯微鏡做到了。它憑借超凡的光譜分辨能力，能將五種高度重疊的熒光信號清晰區(qū)分，實現(xiàn)真正的多色同步成像，揭示出傳統(tǒng)技術(shù)無法呈現(xiàn)的微觀相互作用。

三、智能維度——引入熒光“壽命”的顛覆性技術(shù)TauSense

如果說前兩部分讓STELLARIS 5“看得清”，那么TauSense技術(shù)則讓它 “懂得多” ，能解讀光的 “節(jié)奏” 與 “壽命” 。不同熒光分子被激發(fā)后，發(fā)光的持續(xù)時間（熒光壽命）具有獨特且可測的微小差異，并且對微環(huán)境（如pH、離子濃度、溫度）變化極其敏感。TauSense正是利用這一特性，帶來超越傳統(tǒng)強度成像的全新信息維度

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TauContrast（壽命對比）：繪制細胞內(nèi)的“生理地圖”

TauContrast能直接將熒光壽命的差異轉(zhuǎn)化為圖像對比度。例如，左圖細胞內(nèi)囊泡的pH值差異在強度圖像中難以辨識，但由于特定熒光團的壽命會隨pH變化而變化，TauContrast便能將這些生理參數(shù)的差異可視化，實時繪制出細胞內(nèi)的“pH地圖”或“離子濃度地圖”。

應(yīng)用示例1：記錄鈣信號

鈣信號調(diào)節(jié)諸多生命過程。對于如Oregon Green 488 BAPTA等鈣指示劑，其熒光強度的細微變化在單細胞層面難以可靠測量。右圖TauContrast利用其壽命與鈣濃度相關(guān)的特性，將鈣離子動態(tài)波動清晰、定量地呈現(xiàn)出來，結(jié)果更可靠。

應(yīng)用示例2：內(nèi)源熒光（自發(fā)熒光）記錄

如下圖顯示使用STELLARIS中基于壽命的TauContrast功能，熒光信號可根據(jù)其平均光子到達時間被區(qū)分，正如這張擬南芥葉組織的圖像所示，紅色顯示肌動蛋白（LifeAct-Venus），藍綠色顯示葉綠體自發(fā)熒光。圖中可以清晰地看到肌動蛋白纖維，尤其是葉孔（氣孔）周圍的肌動蛋白纖維的排列以及葉綠體的分布和大小。藍綠色是與熒光壽命差異相關(guān)的不同光子平均到達時間的結(jié)果。由于葉綠體熒光壽命會受局部環(huán)境影響，因此通過這種顏色變化可進一步認識生理條件，而無需額外的標記。

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TauGating（壽命門控）：充當精準的“時間守門員”

此工具可根據(jù)光子到達探測器的早晚來區(qū)分信號。例如，左圖活細胞成像中常見的表面反射光（壽命極短）會干擾真實的熒光信號（壽命較長）。TauGating能像一位嚴格的“守門員”，將早到的反射光“拒之門外”，僅保留晚到的特異性熒光信號，從而獲得無比純凈的圖像。

應(yīng)用示例：消除內(nèi)源色素干擾

在斑馬魚成像中（右圖），內(nèi)源色素與基因編碼的GFP信號混雜。TauGating可以依據(jù)壽命差異，選擇性地僅顯示色素信號或僅顯示GFP信號，完美分離目標與背景。

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TauScan 和TauSeparation：區(qū)分光譜重疊的熒光團

當兩種熒光染料發(fā)射光譜高度重疊、顏色上無法區(qū)分時（如同“雙胞胎”），傳統(tǒng)光譜分離技術(shù)束手無策。左圖所示 TauScan和TauSeparation則通過解析它們熒光壽命的差異，將兩者的信號清晰無誤地分離開來。這極大地擴展了多重標記實驗的可行性，允許研究人員使用更靈活、更豐富的熒光標記組合。

應(yīng)用示例：復(fù)雜組織與細胞器的三維結(jié)構(gòu)解析

憑借優(yōu)異的光學(xué)切片能力和高分辨率三維重建功能，該設(shè)備非常適合用于研究腦切片、胚胎、植物組織、腫瘤球等復(fù)雜樣本的空間結(jié)構(gòu)，或?qū)€粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等亞細胞器進行精細的三維形態(tài)與分布分析。下圖為5色U2OS固定細胞最大投影，所用標記為AF488（微管蛋白，灰色）、SPY555（肌動蛋白，紫色）、MitoTrackerRed（線粒體腔，綠色）、Atto647N（TOM20，線粒體，紅色）、CF770WGA（細胞膜，青色）。

希望本文能幫助您更好地了解這臺‘科研慧眼’。如果您對某個特定應(yīng)用有進一步興趣，或想預(yù)約使用，歡迎在評論區(qū)留言或聯(lián)系儀器平臺。

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