在基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域， RNA G- 四鏈體結(jié)構(gòu)（ rG4s ）長期以來呈現(xiàn)出一個(gè)令人困惑的矛盾現(xiàn)象：體外高通量測序研究顯示 rG4 在體外條件下廣泛形成，但在活細(xì)胞內(nèi)卻主要處于解折疊狀態(tài)；然而，細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)和內(nèi)源基因表達(dá)研究卻清晰展示了 rG4 的形成及其功能。這種“ 體外豐富 - 體內(nèi)稀缺” 的矛盾提示， rG4 結(jié)構(gòu)可能受到精密的動(dòng)態(tài)調(diào)控，但這種調(diào)控的本質(zhì)、分子機(jī)制及其生理病理意義尚不清楚。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為， RNA 解旋酶如 DHX36 的主要功能是解開 rG4 結(jié)構(gòu)，但這一簡單的 " 解旋酶 - 底物 " 模型難以解釋細(xì)胞如何在需要時(shí)維持 rG4 的功能性存在。 卵子發(fā)育過程中，大量合成和儲(chǔ)存 mRNA ，這些母源 mRNA 在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育中選擇性表達(dá)、儲(chǔ)存和降解， 為研究 rG4s 的功能提供了理想的模型。

近日，廣東省第二人民醫(yī)院 孫青原、歐湘紅、孟鐵剛、蘇瑞寶 團(tuán)隊(duì) 在 Nucleic Acids Research 期刊上發(fā)表題為

Ultra-low-input rG4-seq reveals the RNA G-quadruplex regulome in gene expression and genome integrity

首先，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了超低輸入量 rG4 測序技術(shù)（ ULI-rG4-seq ），實(shí)現(xiàn)了從僅 100 個(gè)卵母細(xì)胞進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組 rG4 圖譜繪制的技術(shù)突破。現(xiàn)有 rG4 檢測方法面臨嚴(yán)重的技術(shù)瓶頸： rG4-seq 雖能提供全轉(zhuǎn)錄組圖譜但需體外離子條件處理，可能無法反映生理狀態(tài)； DMS 化學(xué)探針雖可直接檢測細(xì)胞內(nèi)狀態(tài)但易受其他結(jié)構(gòu)元件干擾； G4RP-seq 使用結(jié)構(gòu)特異性探針和化學(xué)交聯(lián)捕獲生理性 G4 ，但對低豐度轉(zhuǎn)錄本敏感性不足——所有這些方法均需要大量起始材料（數(shù)百萬細(xì)胞），限制了在珍貴臨床樣本或稀有細(xì)胞群體中的應(yīng)用。

在卵子中， ULI-rG4-seq 捕獲的 rG4 顯著富集于關(guān)鍵調(diào)控區(qū)域，特別是轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（ TSS ）和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（ TES ）附近?；蚪M分布分析顯示 rG4 在 5'UTR （ 6.69% ）和 3'UTR （ 18.88% ）區(qū)域相對于其基因組大小呈現(xiàn)非隨機(jī)分布，另外在外顯子（ 49.35% ）和內(nèi)含子（ 14.74% ）中也檢測到豐富信號。這種策略性定位提示 rG4 可能作為結(jié)構(gòu)開關(guān)，協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工過程。 進(jìn)一步的功能分析 揭示，含 rG4 的轉(zhuǎn)錄本顯著富集于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的基本生物學(xué)過程，包括 mRNA 加工、染色質(zhì)修飾、細(xì)胞周期控制、翻譯調(diào)控和 RNA 穩(wěn)定性通路。

為闡明 rG4 調(diào)控的基本原理，研究團(tuán)隊(duì)選擇了 DHX36 作為研究對象——這是一個(gè)保守的 rG4 解旋酶，在 RNA 結(jié)構(gòu)調(diào)控中具有潛在作用。 研究團(tuán)隊(duì)建立 純合 Dhx36 敲入小鼠模型（ Dhx36 ki/ki ），表達(dá)內(nèi)源標(biāo)簽 DHX36-GFP 融合蛋白。該模型顯示 DHX36 在整個(gè)發(fā)育過程中主要定位于細(xì)胞質(zhì)，即使核輸出抑制劑 等 處理后仍維持胞質(zhì)定位，提示這是進(jìn)化保守的機(jī)制。

最關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)：通過結(jié)合 DHX36-GFP 敲入模型與 Trim-away 技術(shù)實(shí)現(xiàn)急性蛋白降解，研究者揭示了 一個(gè)意外 現(xiàn)象—— DHX36 急性缺失（ Trim-away 3 小時(shí)內(nèi)降解）導(dǎo)致 rG4 顯著積累，而慢性缺失（ Dhx36 fl/ fl ;SKO 卵母細(xì)胞 ）引起 rG4 水平全局降低（ P < 0.0001 ）。這改變了對 DHX36 的 功能 認(rèn)識(shí)： DHX36 不是簡單解旋酶，而是 rG4 穩(wěn)態(tài)的 " 雙時(shí)相守護(hù)者 " ——既是即時(shí)解旋因子，又是長期水平維持者，揭示了細(xì)胞維持 RNA 結(jié)構(gòu)平衡的精密反饋機(jī)制。

細(xì)胞質(zhì) DHX 36 如何指揮核內(nèi)基因表達(dá) 呢？整合 DHX36 LACE-seq 和 ULI-rG4-seq 數(shù)據(jù)，鑒定出 3,405 個(gè)共享靶標(biāo)（占 DHX36 結(jié)合轉(zhuǎn)錄本 79% ，含 rG4 轉(zhuǎn)錄本 62% ）。盡管 DHX36 主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其缺失卻嚴(yán)重影響核內(nèi)基因表達(dá)。全局轉(zhuǎn)錄分析顯示 Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性顯著降低（ P < 0.0001 ），但 RNA 聚合酶 II （ Pol II ）水平卻升高，提示轉(zhuǎn)錄暫停。 Pol II CUT&Tag 分析證實(shí)， Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母細(xì)胞在 TSS 處出現(xiàn) Pol II 積累，在含 rG4 和 DHX36 結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本中尤為明顯。用 rG4 穩(wěn)定劑 cPDS 處理對照卵母細(xì)胞完全重現(xiàn)了這一表型，建立了 rG4 結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄暫停的因果關(guān)系。機(jī)制研究揭示， DHX36 通過解開轉(zhuǎn)錄延伸正向因子（ P-TEF ）組分 CCNT1 和 TCEA1 轉(zhuǎn)錄本中的 rG4 結(jié)構(gòu)，確保其高效翻譯。盡管 Dhx36 fl/fl ;SKO 卵母細(xì)胞中總 Pol II 升高，延伸型 Pol II （ Ser2 磷酸化）及其激酶 CDK9 水平卻降低（ P < 0.0001 ），表明轉(zhuǎn)錄延伸受損。 顯微注射 RNaseH1 mRNA 或 α - 鵝膏蕈堿抑制轉(zhuǎn)錄均顯著降低 R-loop 和γ H2AX 信號，建立因果關(guān)系。這揭示了機(jī)制級聯(lián)： DHX36 依賴的 rG4 穩(wěn)態(tài)維持→延伸因子適當(dāng)表達(dá)→防止轉(zhuǎn)錄應(yīng)激和 R-loop 形成→維護(hù)基因組完整性。

在生理水平上， DHX36 缺失的雌性小鼠卵子質(zhì)量存在嚴(yán)重缺陷，大部分卵母細(xì)胞停滯在生發(fā)泡（ GV ）階段，無法完成減數(shù)分裂成熟，喪失發(fā)育潛能。組織學(xué)分析揭示 DHX36 敲除小鼠卵泡儲(chǔ)備加速耗竭，呈現(xiàn)典型卵巢早衰（ POF ）表型，完全不育。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)建立了 RNA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)與女性生殖健康的直接因果關(guān)系。

綜上所述， 本研究通過 ULI-rG4-seq 技術(shù) 在理論上 揭示了 DHX36 精密調(diào)控的 RNA G- 四鏈體結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)維持新機(jī)制 ， 建立了關(guān)鍵概念：（ 1 ） RNA 結(jié)構(gòu)調(diào)控的雙時(shí)相特征；（ 2 ）跨區(qū)室調(diào)控機(jī)制；（ 3 ） RNA 結(jié)構(gòu)作為多層次基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的主控開關(guān)；（ 4 ） RNA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)作為基因組完整性的上游保障。 同時(shí)也揭示了 rG4 在卵子發(fā)育、卵子質(zhì)量控制及雌性生殖力維持中發(fā)揮重要作用。 這些進(jìn)步不僅深化了對 RNA 調(diào)控的理解，也為理解卵巢早衰等生殖疾病提供了新視角，并為開發(fā)靶向 RNA 結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)的治療策略奠定了基礎(chǔ)。

論文鏈接：https://doi.org/10.1093/nar/gkag040

制版人：十一

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