撰文|林無隅

CRISPR-Cas 基因組編輯技術(shù)雖然徹底改變了遺傳疾病的治療前景【1】，但第一代技術(shù)依賴于 DNA 雙鏈斷裂（ DSBs ），這可能導(dǎo)致基因毒性和不精確的修復(fù)結(jié)果【2】。盡管堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器避免了 DSBs ，但它們在引入大片段 DNA 以治療囊性纖維化等涉及多種突變的遺傳疾病方面仍面臨巨大挑戰(zhàn)【3-4】?，F(xiàn)有的如 PASSIGE 和 CRISPR 相關(guān)轉(zhuǎn)座子等大片段插入技術(shù)【5】，往往受限于低效率、脫靶插入或產(chǎn)生基因組疤痕等問題 。因此，開發(fā)一種能夠高效、精確地進(jìn)行基因大小的 DNA 片段定點插入，且不依賴宿主同源重組修復(fù)途徑的新型編輯工具，成為該領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題 。

近日 ， 瑞士蘇黎世大學(xué)生物化學(xué)系Martin Jinnek實驗室在 Science 雜志發(fā)表了題為

Programmable genome editing in human cells using RNAguided bridge recombinases

為了尋找在人類細(xì)胞中更有效的橋接重組酶，研究人員對 10 種 IS110 家族的候選系統(tǒng)進(jìn)行了篩選，最終發(fā)現(xiàn)源自 Citrobacter rodentium 的 ISCro4 表現(xiàn)出最高的重組活性 。通過對橋接 RNA 設(shè)計的優(yōu)化，他們發(fā)現(xiàn)將原本連接在一起的 TBL 和 DBL 拆分為兩個獨立的 RNA 分子（即 split-bridge RNA ），可以大幅提升編輯效率，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的重組陽性率從約 36% 躍升至 68% 以上 。此外，實驗還證明了這種拆分 RNA 設(shè)計具有穩(wěn)健的可編程性，能夠引導(dǎo) ISCro4 在新的靶點和供體序列之間進(jìn)行特異性重組 。

為了深入理解 ISCro4 高活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，研究團(tuán)隊解析了分辨率為 2.8 ? 的 ISCro4 突觸復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu) 。結(jié)構(gòu)對比分析顯示，與同家族的 IS621 相比， ISCro4 在與核酸結(jié)合的界面上存在關(guān)鍵的氨基酸差異，例如 Ser13 和 Ser63 位點，這些殘基與向?qū)?RNA 及 DNA 底物形成了額外的氫鍵相互作用 。此外，疏水核心和溶劑暴露表面的氨基酸替換也可能改善了酶在細(xì)胞內(nèi)的溶解度和穩(wěn)定性，這些結(jié)構(gòu)特征共同賦予了 ISCro4 在哺乳動物細(xì)胞中更優(yōu)越的性能 。

在應(yīng)用層面，作者驗證了 ISCro4 在多個臨床相關(guān)基因位點上的編輯能力，包括切除 CNBP 基因中的致病性重復(fù)序列和翻轉(zhuǎn) CFTR 基因的第 23 號外顯子，效率分別達(dá)到約 1% 和 4% 。更為重要的是，該系統(tǒng)實現(xiàn)了在 AAVS1 安全港位點定點插入 3.5 kb 的供體 DNA ，效率超過 6% ，且測序結(jié)果未顯示由于雙鏈斷裂修復(fù)引起的插入缺失（ indels ） 。針對特異性的評估表明，雖然 ISCro4 存在一定的脫靶結(jié)合，但其重組活性主要局限于與向?qū)?RNA 錯配少于 2 個核苷酸的位點，且可以通過選擇獨特的基因組靶點和正交供體序列來進(jìn)一步降低脫靶風(fēng)險 。

綜上所述，本研究證明了ISCro4與其優(yōu)化的拆分橋接RNA系統(tǒng)相結(jié)合，能夠作為一種高效、多功能的工具，在人類細(xì)胞中實現(xiàn)包括大片段插入在內(nèi)的復(fù)雜基因組重排。通過詳細(xì)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析和脫靶檢測，該研究不僅闡明了 ISCro4 高效活性的分子機(jī)制，還提出了通過篩選獨特靶點來規(guī)避脫靶效應(yīng)的可行策略 。鑒于人類蛋白編碼基因中絕大多數(shù)（ 94% ）都包含可被該系統(tǒng)識別的獨特位點， ISCro4 為治療那些現(xiàn)有技術(shù)難以攻克的、需要大片段基因矯正的遺傳疾病提供了極具潛力的轉(zhuǎn)化途徑 。

http://doi.org/10.1126/science.adz1884 (2026).

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

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2. M. Kosicki, K. Tomberg, A. Bradley, Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements.Nat. Biotechnol.36, 765–771 (2018).

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4. A. V. Anzalone, P. B. Randolph, J. R. Davis, A. A. Sousa, L. W. Koblan, J. M. Levy, P.J. Chen, C. Wilson, G. A. Newby, A. Raguram, D. R. Liu, Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature576, 149–157 (2019).

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