單細(xì)胞RNA測(cè)序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）是一種在單個(gè)細(xì)胞水平上全面分析基因表達(dá)譜的高通量技術(shù)。它突破了傳統(tǒng)批量RNA測(cè)序（bulk RNA-seq）只能獲得組織平均表達(dá)信號(hào)的局限，能夠揭示細(xì)胞間的異質(zhì)性、發(fā)現(xiàn)新型細(xì)胞類型、描繪發(fā)育軌跡并解析疾病狀態(tài)下細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化。

核心原理

scRNA-seq的核心原理是在單個(gè)細(xì)胞水平上捕獲并定量其全部mRNA分子，從而解析個(gè)體細(xì)胞的基因表達(dá)譜。

Fig1 批量測(cè)序（左側(cè)）和單細(xì)胞測(cè)序（右側(cè)）的 RNA-seq 數(shù)據(jù)分布情況

左側(cè)（Bulk RNA 測(cè)序）：動(dòng)物占比 83.2%，植物 7.3%，微生物 6.7%，真菌 2.8%。可見傳統(tǒng)測(cè)序雖以動(dòng)物為主，但其他類群（植物、微生物）仍有一定占比。

右側(cè)（單細(xì)胞 RNA 測(cè)序）：動(dòng)物占比飆升至 98.3%，植物、微生物、真菌占比僅 0.7%、0.7%、0.3%。說明單細(xì)胞技術(shù)目前幾乎 “壟斷” 動(dòng)物研究，其他類群（尤其是植物、真菌）的單細(xì)胞研究嚴(yán)重不足。

實(shí)驗(yàn)步驟

單細(xì)胞RNA測(cè)序流程包括：分離單細(xì)胞 → 裂解并逆轉(zhuǎn)錄mRNA為帶UMI和barcode的cDNA → 擴(kuò)增并建庫 → NGS測(cè)序 → 通過聚類、降維（t-SNE/UMAP）和擬時(shí)序分析等解析細(xì)胞類型與功能。

樣本制備：

獲取新鮮組織或細(xì)胞懸液；

機(jī)械/酶消化組織，制備單細(xì)胞懸液；

過濾（40 μm濾網(wǎng)）、離心洗滌，去除細(xì)胞團(tuán)塊和碎片；

裂解紅細(xì)胞（如需要），并通過臺(tái)盼藍(lán)染色或流式檢測(cè)確保細(xì)胞活率 > 80%；

調(diào)整細(xì)胞濃度至平臺(tái)要求（如10x Genomics：700–1200 cells/μL）。

單細(xì)胞捕獲與標(biāo)記：

使用微流控系統(tǒng)（如10x Chromium）、微孔板或納米芯片平臺(tái)，將單個(gè)細(xì)胞與帶有細(xì)胞條形碼（cell barcode）和唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）的凝膠珠共包裹；

每個(gè)細(xì)胞的mRNA被獨(dú)立標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)后續(xù)細(xì)胞來源識(shí)別與分子定量。

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細(xì)胞裂解與逆轉(zhuǎn)錄：

在微滴或反應(yīng)孔中裂解細(xì)胞，釋放mRNA；

利用含poly(T)序列的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成帶有barcode和UMI的一鏈cDNA。

cDNA擴(kuò)增

通過PCR（或部分方法使用體外轉(zhuǎn)錄IVT）對(duì)cDNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增；

純化擴(kuò)增產(chǎn)物，質(zhì)檢（如Qubit定量、Bioanalyzer檢測(cè)片段大?。?。

文庫構(gòu)建：

將cDNA片段化；添加測(cè)序接頭（P5/P7）和樣本索引（index）；構(gòu)建基因表達(dá)文庫（必要時(shí)可同時(shí)構(gòu)建Feature Barcode文庫用于多組學(xué)）；文庫純化并定量。

高通量測(cè)序：

使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序：Read 1：讀取cell barcode + UMI；Read 2：讀取cDNA轉(zhuǎn)錄本序列；

推薦測(cè)序深度：微滴法約20,000–50,000 reads/細(xì)胞。

數(shù)據(jù)質(zhì)控與生物信息學(xué)分析（后續(xù)步驟）。

總結(jié)

單細(xì)胞RNA測(cè)序適用于解析細(xì)胞異質(zhì)性、發(fā)現(xiàn)新型或稀有細(xì)胞類型、重建發(fā)育與分化軌跡、刻畫腫瘤微環(huán)境、揭示疾病機(jī)制（如神經(jīng)或免疫疾病）、評(píng)估藥物響應(yīng)及構(gòu)建器官細(xì)胞圖譜，是研究復(fù)雜組織和動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程的強(qiáng)大工具。

文獻(xiàn)引用

• Arya, A., Tripathi, P., Dubey, N. et al. Navigating single-cell RNA-sequencing: protocols, tools, databases, and applications. Genom. Inform. 23, 13 (2025). https://doi.org/10.1186/s44342-025-00044-5

• Woo H, Eyun SI. Applications and techniques of single-cell RNA sequencing across diverse species. Brief Bioinform. 2025 Jul 2;26(4):bbaf354. doi: 10.1093/bib/bbaf354. PMID: 40698863; PMCID: PMC12284766.

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