【寫在前面】：本期推薦的是由天津醫(yī)科大學(xué)天津市南開(kāi)醫(yī)院急性腹病中西醫(yī)結(jié)合研究所、天津醫(yī)科大學(xué)天津市南開(kāi)醫(yī)院超聲科等研究團(tuán)隊(duì)合作近期發(fā)表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示柴胡桂枝干姜湯通過(guò)調(diào)節(jié)p53/SLC7A11/GPX4通路抑制腺泡細(xì)胞鐵死亡減輕慢性胰腺炎。

【期刊簡(jiǎn)介】

【題目及作者信息】

Chaihu Guizhi Ganjiang decoction attenuates chronic pancreatitis by suppressing acinar cell ferroptosis via regulating p53/SLC7A11/GPX4 pathway

民族藥理學(xué)相關(guān)性

柴胡桂枝干姜湯（CGGD）是一種經(jīng)典中藥復(fù)方，已證實(shí)對(duì)慢性胰腺炎（CP）的胰腺纖維化具有療效。然而，其對(duì)于CP其他關(guān)鍵病理方面的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。

目的

本研究旨在探討CGGD對(duì)CP胰腺腺泡細(xì)胞鐵死亡的保護(hù)作用，并闡明其潛在機(jī)制。

方法

采用二氯二丁基錫（DBTC）誘導(dǎo)4周建立CP大鼠模型，并通過(guò)血清分析和組織病理學(xué)檢查評(píng)估CGGD對(duì)胰腺損傷和纖維化的療效。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了CGGD治療CP的潛在作用靶點(diǎn)。透射電子顯微鏡（TEM）確認(rèn)了鐵死亡的特征性形態(tài)學(xué)標(biāo)志。采用生化測(cè)定法檢測(cè)組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平以及鐵含量。通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)鐵死亡的關(guān)鍵介質(zhì)（TFR1、FTH1、SLC7A11、GPX4、p53），并利用免疫熒光進(jìn)一步確認(rèn)GPX4和p53的定位。在體外實(shí)驗(yàn)中，使用雨蛙素、CGGD含藥血清（CGGDs）、Nutlin-3a（一種p53激活劑）、Erastin（一種SLC7A11抑制劑）或Trp53 siRNA處理AR42J細(xì)胞。使用商用試劑盒、RT-qPCR、Western blot和免疫熒光染色評(píng)估炎癥和鐵死亡的關(guān)鍵介質(zhì)。

結(jié)果

CGGD顯著減輕了DBTC誘導(dǎo)的CP大鼠的胰腺損傷、細(xì)胞死亡和纖維化。機(jī)制上，p53和鐵死亡被確定為CGGD在CP中的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。具體而言，CGGD在體內(nèi)和體外均抑制了p53磷酸化，阻斷了鐵死亡通路的激活，并減輕了氧化應(yīng)激。值得注意的是，在雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中，CGGD誘導(dǎo)的活性氧減少和GSH恢復(fù)可被Nutlin-3a或Erastin聯(lián)合處理顯著逆轉(zhuǎn)。此外，在敲低Trp53后，CGGDs減輕鐵死亡和氧化應(yīng)激的效果并未進(jìn)一步減弱。

結(jié)論

我們的研究結(jié)果表明，CGGD通過(guò)p53/SLC7A11/GPX4軸抑制胰腺腺泡細(xì)胞的鐵死亡，從而闡明了一種CGGD治療CP的新治療機(jī)制。

圖文摘要

【前言】

慢性胰腺炎是一種持續(xù)性的炎癥性疾病，其特征是進(jìn)行性的胰腺纖維化和不可逆的實(shí)質(zhì)破壞。目前，尚無(wú)治療方法能夠阻止或逆轉(zhuǎn)其疾病進(jìn)展。據(jù)估計(jì)，全球CP的發(fā)病率約為每年每10萬(wàn)人10例。CP的病理生理學(xué)主要涉及進(jìn)行性的腺泡細(xì)胞破壞。這會(huì)觸發(fā)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，從而導(dǎo)致胰腺星狀細(xì)胞活化。隨后，活化的PSCs轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，沉積細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（如膠原蛋白和纖連蛋白），最終導(dǎo)致纖維化。進(jìn)行性的纖維化取代了功能性腺泡組織，導(dǎo)致外分泌和內(nèi)分泌功能障礙以及疼痛。最近的研究強(qiáng)調(diào)，腺泡細(xì)胞損傷是CP進(jìn)展過(guò)程中的起始事件。因此，研究腺泡細(xì)胞損傷的新機(jī)制對(duì)于全面理解CP的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要，并可能提供新的藥物治療靶點(diǎn)。

鐵死亡被定義為一種獨(dú)特的程序性細(xì)胞死亡形式，在機(jī)制和形態(tài)上區(qū)別于凋亡、壞死和自噬。它主要由鐵依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化物和活性氧的積累驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜瓦解。該過(guò)程涉及兩個(gè)主要階段：初始的ROS生成，隨后是鐵死亡的執(zhí)行。至關(guān)重要的是，鐵死亡發(fā)生在脂質(zhì)過(guò)氧化、系統(tǒng)Xc?/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）軸以及鐵代謝的交匯點(diǎn)。研究表明，長(zhǎng)期給予右旋糖酐鐵會(huì)誘導(dǎo)小鼠胰腺鐵超載，從而觸發(fā)鐵死亡，隨后促進(jìn)腺泡細(xì)胞死亡和CP樣功能障礙。與此一致的是，人類CP患者和三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的小鼠CP模型均表現(xiàn)出胰腺鐵沉積、鐵死亡活性、纖維化和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。值得注意的是，這些小鼠模型表現(xiàn)出由抗氧化防御不足引起的氧化應(yīng)激平衡受損，從而使胰腺細(xì)胞易于發(fā)生鐵死亡。此外，藥理學(xué)抑制鐵死亡通路（例如，通過(guò)增強(qiáng)GPX4活性）已被證明能有效減輕胰腺纖維化?？傊@些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了鐵死亡對(duì)CP發(fā)病機(jī)制的貢獻(xiàn)，并凸顯了其作為治療靶點(diǎn)的潛力。

作為人類癌癥中最常發(fā)生突變的腫瘤抑制基因之一，腫瘤蛋白p53在細(xì)胞過(guò)程中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)其參與了鐵死亡相關(guān)的代謝途徑，并將其確定為這種細(xì)胞死亡形式的核心調(diào)節(jié)因子。研究表明，溶質(zhì)載體家族7成員11，作為系統(tǒng)Xc?胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的關(guān)鍵組分，在轉(zhuǎn)錄水平上直接被p53抑制。其機(jī)制是，p53與SLC7A11啟動(dòng)子內(nèi)的反應(yīng)元件結(jié)合，抑制其表達(dá)。這減少了細(xì)胞外胱氨酸的攝取，從而限制了GSH的合成。隨之而來(lái)的GSH耗竭損害了GPX4的活性，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化物積累增加，最終觸發(fā)鐵死亡。此外，p53直接上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1和線粒體鐵輸入蛋白SLC25A28的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鐵超載并增強(qiáng)對(duì)鐵死亡的易感性。值得注意的是，在CP患者的組織以及相應(yīng)的小鼠模型中已觀察到p53表達(dá)升高。然而，調(diào)節(jié)p53介導(dǎo)的鐵死亡是否影響CP的發(fā)病機(jī)制仍有待充分闡明。

根據(jù)中醫(yī)理論，CP屬于少陽(yáng)陽(yáng)明合病，表現(xiàn)為腹痛脅脹，涉及肝、膽、脾功能失調(diào)。柴胡桂枝干姜湯源自張仲景的《傷寒論》，正是針對(duì)此類證候。CGGD由七味藥材組成：柴胡、桂枝、干姜、黃芩、天花粉、牡蠣和甘草。在當(dāng)代中醫(yī)醫(yī)院中，該方劑被廣泛用于治療多種消化系統(tǒng)疾病，包括腸易激綜合征、非酒精性脂肪性肝病、慢性非萎縮性胃炎和胰腺癌。劉渡舟教授進(jìn)一步發(fā)展了這一病機(jī)模型，并識(shí)別出口苦、便溏等關(guān)鍵癥狀，以指導(dǎo)CGGD在CP治療中的應(yīng)用。我們之前的研究表明，CGGD能顯著改善DBTC誘導(dǎo)的CP大鼠的胰腺損傷和纖維化。然而，CGGD是否通過(guò)p53介導(dǎo)的鐵死亡來(lái)減輕胰腺腺泡損傷，尚待闡明。

本研究整合了生物信息學(xué)分析、體內(nèi)DBTC誘導(dǎo)的CP大鼠模型以及體外雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞模型，系統(tǒng)地研究了CGGD的治療機(jī)制。我們證明，CGGD通過(guò)抑制腺泡細(xì)胞鐵死亡來(lái)減輕CP中的胰腺損傷和纖維化。從機(jī)制上講，p53被確定為介導(dǎo)CGGD抗鐵死亡作用的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。

【結(jié)果部分】

1.柴胡桂枝干姜湯化學(xué)成分的UHPLC-Q-orbitrap MS分析。

2.柴胡桂枝干姜湯減輕大鼠慢性胰腺炎損傷。

3.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的柴胡桂枝干姜湯治療慢性胰腺炎機(jī)制分析。

4.柴胡桂枝干姜湯對(duì)慢性胰腺炎治療作用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

5.柴胡桂枝干姜湯抑制DBTC誘導(dǎo)的慢性胰腺炎中鐵死亡的發(fā)生。

6. 柴胡桂枝干姜湯抑制慢性胰腺炎中的p53表達(dá)。

7.CGGD含藥血清減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞鐵死亡。

8.CGGD含藥血清抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞中p53的表達(dá)。

9.CGGD含藥血清通過(guò)抑制p53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路介導(dǎo)的鐵死亡減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細(xì)胞損傷。

【結(jié)論與討論】

綜上所述，本研究證實(shí)，柴胡桂枝干姜湯（CGGD）通過(guò)p53/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制腺泡細(xì)胞鐵死亡，從而減輕慢性胰腺炎（圖11）。通過(guò)整合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們闡明了CGGD對(duì)抗CP進(jìn)展的作用機(jī)制。我們的研究結(jié)果確定p53為CGGD的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，CGGD通過(guò)抑制p53的過(guò)度活化（主要通過(guò)減少其第15位絲氨酸的磷酸化）來(lái)抑制鐵死亡。此外，無(wú)論是激活p53還是抑制SLC7A11，均能顯著逆轉(zhuǎn)CGGD的抗鐵死亡作用。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)，CGGD通過(guò)p53/SLC7A11/GPX4通路減輕鐵死亡，從而揭示了其核心作用機(jī)制，為靶向鐵死亡治療CP提供了新的治療策略。

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