革命性凝膠微膠囊技術(shù)CAGES問(wèn)世

在當(dāng)今生命科學(xué)研究中，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已成為揭示細(xì)胞異質(zhì)性與動(dòng)態(tài)過(guò)程的利器。然而，該領(lǐng)域長(zhǎng)期面臨一個(gè)關(guān)鍵瓶頸：如何將需要多步操作、條件各異的基因組學(xué)分析（尤其是涉及活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)）拓展至高通量水平。現(xiàn)有的主流技術(shù)，如微孔板、微滴或細(xì)胞內(nèi)條形碼標(biāo)記，各自在通量、靈敏度或?qū)嶒?yàn)復(fù)雜度上存在局限，難以在維持細(xì)胞活性的同時(shí)，進(jìn)行復(fù)雜的多步驟分子生物學(xué)操作。

為此，哈佛醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)系的Allon M. Klein團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一項(xiàng)突破性技術(shù)——具有兩親性凝膠外殼的膠囊（CAGES）。CAGES能夠選擇性截留細(xì)胞和大分子分析物，同時(shí)允許培養(yǎng)基、酶和小分子試劑自由進(jìn)出，從而首次實(shí)現(xiàn)了將活細(xì)胞培養(yǎng)與全基因組測(cè)序相結(jié)合的高通量多步驟實(shí)驗(yàn)。研究人員還建立了相應(yīng)的膠囊內(nèi)DNA文庫(kù)條形碼標(biāo)記方法，并成功應(yīng)用于對(duì)數(shù)萬(wàn)個(gè)擴(kuò)增細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，以研究基因表達(dá)程序的持久性。CAGES與多種酶促反應(yīng)的兼容性，有望極大擴(kuò)展當(dāng)前單細(xì)胞高通量測(cè)量的范圍，并將其延伸至活細(xì)胞分析領(lǐng)域。相關(guān)論文以“Multistep genomics on single cells and live cultures in subnanoliter capsules”為題，發(fā)表在

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這項(xiàng)技術(shù)的核心在于CAGES獨(dú)特的設(shè)計(jì)與制備。如圖1所示，研究人員利用微流控液滴內(nèi)的液-液相分離技術(shù)，構(gòu)建了由Pluronic F127二丙烯酸酯等兩親性聚合物形成的凝膠外殼。這種外殼具有類(lèi)似泡沫的多孔結(jié)構(gòu)（孔徑10-50納米），能允許小蛋白（如DNA聚合酶）和寡核苷酸等小分子擴(kuò)散通過(guò)，卻能將雙鏈DNA等大分子有效截留在膠囊內(nèi)部的液體核心中（圖1F, G, H, I）。這種可調(diào)控的通透性閾值使CAGES成為一個(gè)物理性質(zhì)穩(wěn)定的通用平臺(tái)，既能像微孔板一樣培養(yǎng)和操作單個(gè)活細(xì)胞或克?。▓D1D），又能像微滴一樣進(jìn)行大規(guī)模并行處理，甚至可以通過(guò)流式細(xì)胞分選儀進(jìn)行分選富集（圖1J）。

圖1：Pluronic二丙烯酸酯膠囊的概念、開(kāi)發(fā)與表征。 （A）半透性膠囊示意圖及其對(duì)高通量單細(xì)胞分析的相關(guān)特性。（B）膠囊中大規(guī)模并行多步驟分析潛力示意圖，包括通過(guò)迭代添加和去除試劑、成像、分選和測(cè)序?qū)蝹€(gè)或培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行處理。（C）明場(chǎng)顯微照片（左）和示意圖（右）顯示使用微滴發(fā)生器共流動(dòng)兩親性功能化外殼聚合物和親水性核心聚合物生成CAGES的過(guò)程，該體系在液滴形成時(shí)發(fā)生相分離。隨后通過(guò)405nm依賴的外殼聚合物交聯(lián)將其轉(zhuǎn)化為CAGES。紅色箭頭指示單個(gè)細(xì)胞。插圖為間隔0.12秒的兩個(gè)快照。比例尺 = 100 μm。（D）在含有單個(gè)細(xì)胞的DPBS中，8% (w/v):1% (w/v) F127DA:PPPDA外殼、13% (w/v)葡聚糖核心的CAGES的明場(chǎng)顯微照片。（E）明場(chǎng)顯微照片證明多種兩親性PEG共聚物可形成膠囊。比例尺 = 50 μm。（F）冷凍斷裂膠囊的冷凍掃描電鏡圖像，顯示Pluronic二丙烯酸酯外殼膜上孔隙的放大圖。紅色箭頭指向表面孔隙。（G）分析物擴(kuò)散時(shí)間序列中膠囊的共聚焦和明場(chǎng)成像的示例合成顯微照片。（H）量化不同大小分析物在不同鹽濃度存在下通過(guò)CAGE外殼的擴(kuò)散半衰期的強(qiáng)度時(shí)間序列。（I）擴(kuò)散半衰期顯示CAGE通透性存在尖銳的尺寸依賴性截?cái)?。圖表表示來(lái)自≥3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均數(shù)據(jù)，誤差條為標(biāo)準(zhǔn)差；完整數(shù)據(jù)見(jiàn)表S2。（J）基于流式細(xì)胞術(shù)的CAGES富集。初始含有<10%標(biāo)記膠囊的樣本（左上）和分選后樣本（右上）的合成熒光和明場(chǎng)顯微照片，分選后產(chǎn)生約98% FITC陽(yáng)性CAGES（下圖）。比例尺 = 100 μm。

為實(shí)現(xiàn)對(duì)海量膠囊內(nèi)樣本的高通量測(cè)序，團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了名為“inC-seq”的靈活拆分-合并條形碼標(biāo)記策略（圖2A）。該策略通過(guò)在膠囊內(nèi)進(jìn)行多輪連接和PCR反應(yīng)，為每個(gè)膠囊內(nèi)的DNA文庫(kù)賦予獨(dú)特的組合條形碼。實(shí)驗(yàn)證明，該方法能高效地區(qū)分來(lái)自不同膠囊的樣本，交叉污染率極低，與泊松加載模型的預(yù)期一致（圖2D）。這表明CAGES在整個(gè)復(fù)雜的多步條形碼標(biāo)記過(guò)程中，能有效地隔離每個(gè)單元內(nèi)的生物材料。

圖2：基于拆分-合并策略的CAGES條形碼標(biāo)記用于高通量測(cè)序（inC-seq）。 （A）膠囊內(nèi)DNA文庫(kù)拆分-合并條形碼標(biāo)記示意圖，展示了本工作中使用的通過(guò)連接和PCR進(jìn)行三輪條形碼標(biāo)記的示例。初始文庫(kù)在共同文庫(kù)末端序列中含有一個(gè)尿嘧啶殘基（紅色），該殘基可被尿嘧啶特異性切除試劑切割，產(chǎn)生具有5‘-磷酸的黏性末端。該黏性末端與含有孔板特異性條形碼的條形碼雙鏈寡核苷酸陣列連接。重復(fù)此過(guò)程以引入第二個(gè)條形碼，并通過(guò)PCR引物引入第三個(gè)條形碼。（B）在CAGES中高效順序酶促處理DNA的演示，實(shí)現(xiàn)了（A）中的步驟（1）。初始未標(biāo)記文庫(kù)（左圖）通過(guò)將膠囊在PCR反應(yīng)混合物中孵育進(jìn)行擴(kuò)增，PCR引物含有尿嘧啶和其3‘末端的Cy5標(biāo)記。PCR和洗滌后（中圖），CAGES顯示出保留了現(xiàn)在附著在膠囊內(nèi)DNA上的Cy5熒光。尿嘧啶切除和洗滌切除了標(biāo)記引物，產(chǎn)生突出端并失去Cy5熒光（右圖）。（C）五步條形碼標(biāo)記方法后DNA擴(kuò)增子測(cè)序數(shù)據(jù)中的條形碼表示：在擴(kuò)增期間添加了14個(gè)PCR條形碼，隨后進(jìn)行3步48重拆分-合并條形碼添加和膠囊溶解后的16個(gè)索引。（D）通過(guò)膠囊有效分離文庫(kù)，通過(guò)單細(xì)胞gDNA轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)（編碼GFP或RFP序列）的inC-seq分析觀察到低交叉污染。圖表顯示映射到GFP或RFP的讀數(shù)數(shù)量，每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)唯一的膠囊條形碼。觀察到的雙聯(lián)體率符合預(yù)期（2.1%），對(duì)應(yīng)于平均細(xì)胞負(fù)載為0.1個(gè)細(xì)胞/CAGE、觀察到細(xì)胞負(fù)載比例為70:30 RFP:GFP生成的CAGES。插圖為裂解前含有細(xì)胞的CAGES示例。比例尺 = 50 μm。

憑借CAGES的通用性，研究人員成功建立了多種單細(xì)胞基因組學(xué)分析方法。他們優(yōu)化了單膠囊轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（inC-RNA-seq）和單膠囊染色質(zhì)可及性測(cè)序（inC-ATAC-seq）方案（圖3A, B）。無(wú)論是分析人鼠混合細(xì)胞以驗(yàn)證樣本隔離效果（圖3C, D），還是對(duì)標(biāo)商業(yè)液滴系統(tǒng)（10x Genomics）的性能，inC-RNA-seq均展現(xiàn)出高靈敏度和可重復(fù)性（圖3E）。此外，該技術(shù)還成功應(yīng)用于處理固定后復(fù)蘇、低溫凍存甚至在培養(yǎng)基中直接封裝的細(xì)胞樣本，顯示出處理復(fù)雜樣本的巨大潛力（圖3F-H）。在對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的大規(guī)模分析中，inC-RNA-seq獲得了超過(guò)4.3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，清晰解析了PBMC的各類(lèi)細(xì)胞亞群，其性能與主流方法相當(dāng)（圖3I-M）。

圖3：膠囊通過(guò)多步處理實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞基因組學(xué)分析。 （A）inC-RNA-seq和inC-ATAC-seq文庫(kù)制備模式的示意圖。在通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座步驟捕獲轉(zhuǎn)錄本（RTb和UMI）和可及gDNA區(qū)域（Tn5b）期間，會(huì)添加額外的條形碼和序列。捕獲并擴(kuò)增的含dU分子經(jīng)過(guò)拆分-合并條形碼標(biāo)記和測(cè)序。（B）顯微照片顯示在CAGES中進(jìn)行單細(xì)胞RNA-seq文庫(kù)制備的連續(xù)階段，從初始細(xì)胞封裝到裂解，再到in-CAGE條形碼標(biāo)記前生成擴(kuò)增的互補(bǔ)DNA（cDNA）文庫(kù)。gDNA用SYBR Safe染料染色；cDNA用與PCR擴(kuò)增引物結(jié)合的Cy5熒光團(tuán)染色。（C和D）圖表顯示每個(gè)CAGE對(duì)應(yīng)的映射到人（y軸）和小鼠（x軸）RNA-seq（左）或ATAC-Seq（右）inC-seq文庫(kù)的UMI或DNA片段數(shù)量。觀察到的混合物種雙聯(lián)體率符合預(yù)期：（C）為2.1%（負(fù)載為0.083個(gè)細(xì)胞/CAGE），（D）為1.9%（負(fù)載為0.1個(gè)細(xì)胞/CAGE）。（E）對(duì)來(lái)自CAGE scRNA-seq文庫(kù)的讀數(shù)進(jìn)行下采樣后，與公開(kāi)可用的10x Genomics NextGem v3.1數(shù)據(jù)比較的UMI/reads圖表。（F至H）針對(duì)從新鮮或PFA固定的K562細(xì)胞（F）、新鮮或冷凍的HEK293T細(xì)胞（G）或使用DPBS或培養(yǎng)基制備的膠囊（H）生成的文庫(kù)，如（E）的UMI/reads圖表。（I）來(lái)自外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的inC-RNA-Seq數(shù)據(jù)的二維UMAP嵌入。（J）顯示低豐度和高豐度細(xì)胞類(lèi)型特異性基因覆蓋度的基因表達(dá)熱圖，以及（K）T細(xì)胞和NK細(xì)胞亞群劃分的高分辨率群體結(jié)構(gòu)。（L）如（F）生成的UMI/reads圖表，現(xiàn)針對(duì)PBMC數(shù)據(jù)生成，并比較inC-seq與10x Genomics GEMCode的數(shù)據(jù)。（M）比較inC-seq和10x Genomics NextGem v3.1之間，每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到的基因數(shù)量與測(cè)序深度的函數(shù)關(guān)系。

CAGES最具革命性的應(yīng)用在于其支持大規(guī)模的活細(xì)胞克隆培養(yǎng)與功能分析。通過(guò)優(yōu)化封裝條件，研究人員成功在膠囊內(nèi)培養(yǎng)了多種細(xì)胞系、小鼠原代造血干細(xì)胞乃至人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，且細(xì)胞在膠囊內(nèi)的分裂速度與在培養(yǎng)板中無(wú)顯著差異，轉(zhuǎn)錄組也未發(fā)生顯著改變（圖4A-C）。利用這一能力，他們?cè)O(shè)計(jì)了一項(xiàng)大規(guī)模平行活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以研究表觀遺傳記憶的持久性以及藥物對(duì)其的影響。他們將經(jīng)過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（地西他濱、5-氮雜胞苷）或組蛋白去乙?；敢种苿ǚ⒅Z他）預(yù)處理的K562和L1210癌細(xì)胞封裝入CAGES，在持續(xù)給藥條件下培養(yǎng)6天，并分時(shí)間點(diǎn)對(duì)數(shù)千個(gè)克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（圖4D）。通過(guò)非負(fù)矩陣分解分析，他們識(shí)別出在克隆間持續(xù)異質(zhì)表達(dá)的基因程序（圖4E, F, G），其中一些程序在克隆擴(kuò)增后仍保持互斥表達(dá)模式（圖4H）。

圖4：CAGES中的活細(xì)胞克隆擴(kuò)增揭示了持續(xù)的基因表達(dá)程序。 （A）顯示培養(yǎng)細(xì)胞系、小鼠原代骨髓造血干細(xì)胞（mHSCs）和人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）的克隆在CAGES中生長(zhǎng)的顯微照片。比例尺 = 50 μm。（B）同時(shí)培養(yǎng)的封裝克隆的顯微照片。比例尺 = 100 μm。圖像顯示了在CAGES中擴(kuò)增的高密度K562（多克?。┛寺　＃–）在培養(yǎng)板或CAGES中培養(yǎng)的細(xì)胞的分裂時(shí)間。每個(gè)點(diǎn)對(duì)應(yīng)于通過(guò)延時(shí)顯微鏡評(píng)估的單個(gè)細(xì)胞分裂時(shí)間（K562: n=156；L1210: n=127）。t檢驗(yàn)p值>0.8。（D）用于鑒定癌細(xì)胞系在經(jīng)載體（對(duì)照）、DNMT抑制劑（5-氮雜胞苷（Aza）；地西他濱（Dec））或HDAC抑制劑（伏立諾他（Vor））處理后，持續(xù)基因表達(dá)程序的實(shí)驗(yàn)方案圖。顯微照片顯示了不同時(shí)間點(diǎn)的示例膠囊。（E至H）K562細(xì)胞中持續(xù)基因表達(dá)程序的證據(jù)；L1210細(xì)胞見(jiàn)圖S6。（E）在第4-6天K562細(xì)胞對(duì)照樣本中，克隆間基因-基因表達(dá)相關(guān)性聚類(lèi)顯示出結(jié)構(gòu)化的程序證據(jù)，而當(dāng)隨機(jī)將第0天取樣的細(xì)胞組合成“模擬”克隆時(shí)，這些程序消失。（F）通過(guò)非負(fù)矩陣分解（NMF）鑒定的基因表達(dá)程序的主要貢獻(xiàn)基因，識(shí)別出紅系、細(xì)胞周期、波形蛋白和角蛋白相關(guān)程序。完整程序負(fù)載見(jiàn)表S3。（G）對(duì)照克隆之間15個(gè)NMF衍生程序變異的箱線圖，顯示與模擬克隆相比，隨時(shí)間推移存在持續(xù)的異質(zhì)性。（H）一些基因表達(dá)程序在克隆擴(kuò)增后仍保持互斥性，從觀察到的混合NMF程序克隆數(shù)量低于預(yù)期可以看出（觀察值/預(yù)期值 = fObs/fExp；p值來(lái)自Fisher精確檢驗(yàn)）。

通過(guò)對(duì)克隆生長(zhǎng)過(guò)程中基因程序使用情況的動(dòng)態(tài)建模與統(tǒng)計(jì)推斷（圖5A, B），研究人員量化了每種藥物對(duì)特定基因程序狀態(tài)切換速率和穩(wěn)態(tài)偏好的影響（圖5C, D, E）。有趣的是，與預(yù)期相反，這些表觀遺傳藥物并未普遍降低克隆異質(zhì)性，而是以程序特異性的方式改變了狀態(tài)的持久性。例如，在K562細(xì)胞中，所有三種藥物都促使細(xì)胞向紅系分化狀態(tài)（程序3）偏移，并增加了該分化狀態(tài)的持久性（圖5C）。這些變化與單個(gè)基因的平均表達(dá)變化并不完全一致（圖5F），揭示了藥物作用更復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)層面。

圖5：DNMT或HDAC抑制劑處理后克隆記憶的改變。 （A）藥物治療對(duì)表觀遺傳記憶可能影響的示意圖。在未經(jīng)處理的對(duì)照中，細(xì)胞占據(jù)每個(gè)觀察到的程序的高和低基因表達(dá)狀態(tài)。表觀遺傳修飾酶抑制劑可能會(huì)改變狀態(tài)的相對(duì)穩(wěn)定性（上圖情景），也可能降低持久性（較淺的能阱，下圖情景）。通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)中的克隆進(jìn)行inC-RNA-seq，可以推斷出狀態(tài)轉(zhuǎn)換速率（箭頭）。（B）通過(guò)將細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的隨機(jī)模型擬合到觀察到的隨時(shí)間變化的NMF程序使用情況，從克隆inC-RNA-seq數(shù)據(jù)推斷轉(zhuǎn)換速率的方案圖。該模型用于推斷每種處理?xiàng)l件下每個(gè)程序的程序誘導(dǎo)速率（r01）和丟失速率（r10）（見(jiàn)補(bǔ)充文本1）。（C）以一個(gè)程序（程序3）為例的擬合轉(zhuǎn)換速率，所有藥物都增加了“高”狀態(tài)的持久性，同時(shí)使“低”狀態(tài)不穩(wěn)定。（D）從擬合的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換速率得出的K562基因表達(dá)程序持久性時(shí)間的變化，顯示一些程序的克隆記憶減少（藍(lán)色），但其他程序則未減少（紅色）。（E）相應(yīng)的穩(wěn)態(tài)偏好（即活躍狀態(tài)細(xì)胞比例）變化，顯示出與程序持久性不同的變化。（F）持久性的變化與單個(gè)基因平均表達(dá)的變化不同，以K562細(xì)胞中的一種藥物（Aza）為例顯示。

總之，CAGES技術(shù)的建立為高通量單細(xì)胞及單克隆基因組分析提供了一個(gè)多功能平臺(tái)。它不僅兼容復(fù)雜的多步驟分子生物學(xué)反應(yīng)，更首次將大規(guī)?；罴?xì)胞培養(yǎng)與功能性基因組讀數(shù)無(wú)縫連接。盡管當(dāng)前技術(shù)在用于單細(xì)胞分析時(shí)存在空膠囊、反應(yīng)條件需優(yōu)化以及活細(xì)胞回收困難等局限性，但其在分析難處理樣本、研究細(xì)胞間相互作用（如發(fā)育或免疫互作）、大規(guī)模類(lèi)器官或克隆形成實(shí)驗(yàn)等方面前景廣闊。CAGES有望成為連接細(xì)胞表型與基因型的有力工具，助力構(gòu)建數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)預(yù)測(cè)模型，推動(dòng)基礎(chǔ)生物學(xué)研究和精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。