近日，西北農(nóng)林科技大學(xué)、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心及哈爾濱獸醫(yī)研究所聯(lián)合在病毒學(xué)國際知名期刊Journal of Virology上發(fā)表了題為“Role of g5Rp in African swine fever virus replication: disruption of host translation and autophagy”的研究論文，解析了g5Rp的蛋白晶體結(jié)構(gòu)，闡明了ASFV進入宿主細胞后的快速復(fù)制的機制，并基于g5Rp晶體結(jié)構(gòu)、分子對接及分子動態(tài)模擬，鑒定了g5Rp的天然小分子抑制劑9"-methyl salvianolate B，其可顯著抑制病毒復(fù)制，為抗ASF藥物研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus）引起的急性、高致病性和高致死率的傳染病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。在非洲豬瘟病毒（ASFV）復(fù)制早期，g5Rp蛋白扮演著“翻譯總控開關(guān)” 的關(guān)鍵角色。它像一個分子扳道工，能強行將宿主細胞的翻譯機器，從生產(chǎn)自身蛋白的軌道，切換到全力合成病毒蛋白的軌道上，即抑制宿主蛋白的合成，促進病毒蛋白的合成，從而實現(xiàn)病毒的快速增殖。

具體而言，g5Rp通過其Nudix水解酶活性降解宿主mRNA的5‘帽子結(jié)構(gòu)，并破壞eIF5A-RPS15互作，從而雙重抑制宿主翻譯。這并非單純的關(guān)閉，而是通過解除宿主翻譯優(yōu)勢，為病毒mRNAs（其翻譯不依賴于經(jīng)典帽子結(jié)構(gòu)）競爭核糖體資源創(chuàng)造了有利條件，實質(zhì)上是將宿主翻譯系統(tǒng)重定向為病毒復(fù)制服務(wù)。

主要研究結(jié)果如下：

1.g5Rp促進ASFV的復(fù)制并調(diào)節(jié)宿主翻譯與自噬途徑

通過構(gòu)建g5Rp過表達和siRNA干擾模型，實驗結(jié)果顯示，過表達g5Rp顯著提升了病毒滴度及病毒蛋白p30的表達水平，而干擾g5Rp則明顯抑制病毒復(fù)制，表明其具有促進病毒復(fù)制的功能。進一步通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，g5Rp可調(diào)控宿主細胞內(nèi)122種蛋白的表達，主要涉及翻譯調(diào)控、自噬、細胞凋亡等關(guān)鍵生物過程。GO和KEGG富集分析顯示，g5Rp顯著影響翻譯因子活性、溶酶體功能及自噬通路，提示其通過重塑宿主細胞環(huán)境，為病毒復(fù)制創(chuàng)造有利條件。

圖1. g5Rp促進ASFV復(fù)制并重塑宿主翻譯和自噬途徑

2.g5Rp與eIF5A和RPS15相互作用促進ASFV復(fù)制

Co-IP、PLA與過表達/敲低實驗證實，g5Rp同時結(jié)合eIF5A和RPS15，降低eIF5A總量及其hypusination修飾，削弱RPS15的核糖體定；eIF5A敲低或RPS15過表達均顯著升高病毒滴度和p30表達，而eIF5A過表達則抑制復(fù)制。結(jié)果揭示g5Rp通過雙重劫持宿主翻譯核心組分，打破eIF5A-RPS15功能復(fù)合體，從而優(yōu)先保障病毒蛋白合成并促進ASFV復(fù)制。

圖2. g5Rp與eIF5A和RPS15相互作用，調(diào)節(jié)宿主翻譯以增強ASFV復(fù)制

3.g5Rp干擾eIF5A和RPS15之間的相互作用，抑制宿主翻譯

Co-IP 與鄰近連接實驗顯示，g5Rp可競爭性干擾eIF5A與RPS15之間的相互作用。嘌呤霉素摻入實驗發(fā)現(xiàn)，過表達g5Rp 以時間和劑量依賴性降低宿主翻譯，同時提高病毒蛋白的表達。eIF5A或RPS15單獨敲低證實了該表型，而eIF5A-RPS15融合蛋白則完全恢復(fù)翻譯水平。點突變證實g5Rp SER118/206與ASN61為關(guān)鍵競爭位點，突變后不再阻斷eIF5A-RPS15互作，翻譯抑制與促病毒效應(yīng)降低，確證破壞這一復(fù)合體是g5Rp關(guān)閉宿主翻譯、助力ASFV復(fù)制的核心策略。

圖3. g5Rp破壞eIF5A-RPS 15相互作用并抑制宿主翻譯

4.g5Rp通過破壞eIF5A-TFEB軸而損害自噬

研究發(fā)現(xiàn)，g5Rp通過破壞eIF5A-TFEB軸顯著抑制宿主自噬。過表達g5Rp導(dǎo)致自噬底物p62積聚、LC3-II/I比值下降，提示自噬體-溶酶體通路受阻。機制上，g5Rp下調(diào)eIF5A總蛋白及其hypusination修飾，削弱其對TFEB翻譯的支持，從而阻斷TFEB核轉(zhuǎn)位；eIF5A抑制劑GC7或基因敲低均可模擬該自噬抑制表型?；匮a實驗顯示，恢復(fù)eIF5A水平可逆轉(zhuǎn)p62累積并重建自噬流。結(jié)果闡明g5Rp以eIF5A為支點，切斷TFEB介導(dǎo)的溶酶體生物發(fā)生，營造抑制性胞內(nèi)環(huán)境，間接促進ASFV復(fù)制。

圖4. g5Rp通過下調(diào)eIF5A來降低細胞自噬

5.g5Rp與eIF5A或RPS15結(jié)合的關(guān)鍵相互作用位點

為精確定位g5Rp與eIF5A/RPS15的結(jié)合位點，作者首先解析g5Rp晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其以同源二聚體形式存在，表面形成連續(xù)疏水溝槽。分子對接與氫鍵網(wǎng)絡(luò)分析鎖定SER118、SER206及ASN61為關(guān)鍵氨基酸。將三位點同時突變?yōu)锳LA后，g5Rp幾乎喪失與eIF5A/RPS15的互作能力。且g5Rp的突變體不在具備促病毒復(fù)制的能力。

6.9''-methyl salvianolate B結(jié)合ASFV g5Rp并調(diào)節(jié)eIF5A和RPS15相互作用

虛擬篩選與表面離子共振（SPR）鑒定出與g5Rp互作的天然化合物9''-methyl salvianolate B，可高親和力結(jié)合g5Rp，與LYS4、TYR174、LYS127、ASP169形成氫鍵/疏水網(wǎng)絡(luò)。在安全濃度（10 μM，CC50=16.22 μM）下，該化合物可抑制g5Rp與eIF5A/RPS15復(fù)合物形成并恢復(fù)內(nèi)源性eIF5A-RPS15互作功能；提升eIF5A hypusination水平，恢復(fù)部分蛋白合成并緩解G0/G1阻滯；促進TFEB核轉(zhuǎn)位，提高LC3-II/LC3-I比值、降低p62水平，自噬功能得到恢復(fù)；同時，病毒基因轉(zhuǎn)錄（p72/p54/p30/g5Rp）與病毒滴度均顯著下降。本研究表明天然化合物9''-methyl salvianolate B通過靶向g5Rp并阻斷其與宿主因子eIF5A/RPS15的相互作用，有效恢復(fù)宿主翻譯與自噬功能，抑制非洲豬瘟病毒復(fù)制，為開發(fā)靶向病毒-宿主互作界面的抗ASFV藥物提供了具有潛力的先導(dǎo)化合物。

7.9''-methyl salvianolate B可恢復(fù)宿主功能并抑制ASFV的復(fù)制

9''-methyl salvianolate B以117 nM親和力占據(jù)g5Rp疏水口袋，阻斷其與eIF5A/RPS15的結(jié)合，恢復(fù)宿主翻譯和自噬。具體表現(xiàn)在，eIF5A hypusination水平恢復(fù)，提高宿主翻譯水平；增加TFEB的核移位水平，恢復(fù)細胞自噬。且9''-methyl salvianolate B可在一定程度抑制ASFV的復(fù)制。

綜上，該研究發(fā)現(xiàn)g5Rp其通過競爭性抑制eIF5A-RPS15互作，阻斷宿主蛋白質(zhì)合成與自噬通路，進而促進ASFV復(fù)制，研究結(jié)果揭示了g5Rp促進ASFV復(fù)制的機制。同時解析了g5Rp的晶體結(jié)構(gòu)，鑒定了與g5Rp互作的小分子候選物9''-methyl salvianolate B，為靶向病毒-宿主互作位點的抗ASFV藥物研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

g5Rp在ASFV復(fù)制中的機制示意圖

本研究的第一作者為西北農(nóng)林科技大學(xué)許春梅博士，通訊作者為西北農(nóng)林科技大學(xué)趙曉民教授、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心王志亮研究員、哈爾濱獸醫(yī)研究所翁長江研究員。