摘要：α1-抗胰蛋白酶（A1AT）是臨床剛需的生物制劑，傳統(tǒng)血漿提取法一直受困于成本高、供應(yīng)不穩(wěn)定等瓶頸。近期一項(xiàng)研究帶來(lái)了新希望：科研團(tuán)隊(duì)耗時(shí)12周篩選出高穩(wěn)定性、高產(chǎn)量的CHO細(xì)胞單克隆株，并首次在10L一次性表面通氣軌道搖瓶生物反應(yīng)器（SB10-X）中，成功實(shí)現(xiàn)重組人A1AT（rhA1AT）的補(bǔ)料分批培養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)。實(shí)驗(yàn)最高效價(jià)沖到了789mg/L，細(xì)胞比生產(chǎn)力也與搖瓶水平相當(dāng)。更關(guān)鍵的是，研究還完成了rhA1AT的純化與活性驗(yàn)證，這不僅為擺脫血漿依賴提供了可行方案，也為同類重組蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)辟了新思路。

一、臨床剛需下，rhA1AT量產(chǎn)迫在眉睫

A1AT是人體里至關(guān)重要的絲氨酸蛋白酶抑制劑，它的核心使命就是抑制中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，守護(hù)我們脆弱的肺部肺泡組織。作為α1-抗胰蛋白酶缺乏癥的唯一FDA批準(zhǔn)治療藥物，它的地位無(wú)可替代。有趣的是，近年研究還發(fā)現(xiàn)了它的“隱藏技能”——抗炎和免疫調(diào)節(jié)，這讓它在移植物抗宿主病、糖尿病等領(lǐng)域也展現(xiàn)出潛力。臨床需求在持續(xù)攀升，但血漿提取法的短板太明顯了。不僅供體資源有限，還存在潛在的病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)，規(guī)模化生產(chǎn)更是難上加難。開(kāi)發(fā)重組蛋白生產(chǎn)工藝，已經(jīng)成了行業(yè)必須邁過(guò)去的坎。

二、12周嚴(yán)苛篩選，鎖定高優(yōu)CHO細(xì)胞單克隆株

要做出好藥，第一步得有好的“細(xì)胞工廠”。研究團(tuán)隊(duì)從rhA1AT生產(chǎn)細(xì)胞池中，先拿到了10株CHO單克隆細(xì)胞。為了找到最能打的那一個(gè)，他們進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)12周的嚴(yán)苛考驗(yàn)，分別在含300nM MTX和無(wú)MTX兩種條件下，觀察細(xì)胞的生產(chǎn)穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特性（圖1，來(lái)源：本文研究數(shù)據(jù)）。積分活細(xì)胞密度（IVCD）、比生長(zhǎng)速率、相對(duì)比生產(chǎn)力，每一項(xiàng)都是硬指標(biāo)。數(shù)據(jù)顯示，不同克隆株的性能差異非常大：Clone 9的相對(duì)效價(jià)最高，而Clone 2則是“全能選手”，兼顧了高生長(zhǎng)速率和穩(wěn)定的生產(chǎn)力。最終，Clone 2憑借無(wú)可爭(zhēng)議的綜合實(shí)力，成為了后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)的核心細(xì)胞株（圖2，來(lái)源：本文研究數(shù)據(jù)）。

圖1：10株CHO細(xì)胞單克隆株的（a）IVCD、（b）比生長(zhǎng)速率、（c）相對(duì)Clone 1的最高效價(jià)對(duì)比

圖2：無(wú)MTX（a）和含300nM MTX（b）條件下，10株CHO單克隆株第0-12周的相對(duì)比生產(chǎn)力變化

三、10L反應(yīng)器規(guī)模化生產(chǎn)，效價(jià)遠(yuǎn)超搖瓶水平

確定了Clone 2這個(gè)“種子選手”，下一步就是放大生產(chǎn)。團(tuán)隊(duì)先在搖瓶里做了預(yù)實(shí)驗(yàn)，最高活細(xì)胞密度達(dá)到1.17×10?cells/mL，收獲效價(jià)437mg/L，這個(gè)數(shù)據(jù)其實(shí)已經(jīng)不錯(cuò)了。真正的重頭戲，是把工藝放大到10L SB10-X軌道搖瓶生物反應(yīng)器。實(shí)驗(yàn)做了兩次平行樣，重點(diǎn)考驗(yàn)了設(shè)備對(duì)溶氧和pH的調(diào)控能力。結(jié)果很驚喜，溶解氧穩(wěn)定維持在40%以上，pH也精準(zhǔn)鎖定在7.1±0.05。反應(yīng)器里的細(xì)胞生長(zhǎng)勢(shì)頭和搖瓶高度一致，最高活細(xì)胞密度甚至沖到了1.29×10?cells/mL（圖3，來(lái)源：本文研究數(shù)據(jù)）。更關(guān)鍵的是，兩次實(shí)驗(yàn)的最高效價(jià)分別達(dá)到789mg/L和729mg/L，比搖瓶水平提升了近80%。這組數(shù)據(jù)有力地證實(shí)了工藝的可放大性，完全超出了預(yù)期。

圖3：搖瓶與10L SB10-X反應(yīng)器兩次實(shí)驗(yàn)的（a）活細(xì)胞密度與活力、（b）rhA1AT效價(jià)、（c-h）營(yíng)養(yǎng)物與代謝物變化對(duì)比

四、rhA1AT的穩(wěn)定性與純化：解鎖下游工藝關(guān)鍵要點(diǎn)

生產(chǎn)出來(lái)只是第一步，能不能穩(wěn)定、能不能純化，才是決定成本的關(guān)鍵。研究團(tuán)隊(duì)首先測(cè)試了pH穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要特性：rhA1AT在pH7.0時(shí)最穩(wěn)定，一旦pH降到3.0-5.0，可檢測(cè)的蛋白量就會(huì)大幅下降（圖4，來(lái)源：本文研究數(shù)據(jù)）。這意味著單抗生產(chǎn)中常用的低pH病毒滅活工藝，在這里根本用不了，后續(xù)必須開(kāi)發(fā)干熱或去污劑處理等替代方案。在純化環(huán)節(jié)，團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一套“深度過(guò)濾+兩步層析”的工藝，再結(jié)合切向流過(guò)濾換液。最終的成果非常漂亮，HPLC檢測(cè)呈現(xiàn)出單一的特征峰（圖6，來(lái)源：本文研究數(shù)據(jù)）。純化后，蛋白的彈性蛋白酶抑制活性從37%提升到65%并保持穩(wěn)定（圖5，來(lái)源：本文研究數(shù)據(jù)），回收率也達(dá)到了70%左右。這套工藝的有效性，算是被實(shí)打?qū)嶒?yàn)證了。

圖4：pH3.0-7.0條件下，ELISA可檢測(cè)的rhA1AT相對(duì)保留量

圖5：未純化、陰離子交換層析后、疏水相互作用層析+換液后rhA1AT的相對(duì)彈性蛋白酶抑制活性

圖6：（a）rhA1AT細(xì)胞培養(yǎng)收獲液、（b）純化后rhA1AT的HPLC色譜圖

五、亮點(diǎn)與展望：搖瓶反應(yīng)器成生物制造新選擇

聊到這里，這次研究最大的亮點(diǎn)其實(shí)已經(jīng)很清晰了。那就是一次性表面通氣軌道搖瓶生物反應(yīng)器的首次應(yīng)用。相比于傳統(tǒng)的攪拌式生物反應(yīng)器，這款設(shè)備操作起來(lái)簡(jiǎn)直太友好了，不僅簡(jiǎn)單，還能有效減少剪切力對(duì)CHO細(xì)胞的損傷。對(duì)于生物醫(yī)藥研發(fā)，尤其是早期臨床生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，一次性耗材的設(shè)計(jì)大大降低了設(shè)備投入和清潔成本，性價(jià)比極高。

當(dāng)然，工藝還有優(yōu)化的空間。比如乳酸、銨離子等代謝物的積累，還是會(huì)影響細(xì)胞的存活時(shí)間。后續(xù)可以從營(yíng)養(yǎng)配比、補(bǔ)料策略，甚至培養(yǎng)溫度、滲透壓這些細(xì)節(jié)入手，進(jìn)一步延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，把效價(jià)再往上推一推。整體來(lái)看，這項(xiàng)研究搭建起了從細(xì)胞株篩選到10L規(guī)模生產(chǎn)，再到純化驗(yàn)證的rhA1AT完整生產(chǎn)工藝。它不僅為rhA1AT的低成本量產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，也給整個(gè)重組蛋白生物制造領(lǐng)域，提供了一個(gè)極具參考價(jià)值的新范式。

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