骨關(guān)節(jié)炎不只是“磨損”，而是關(guān)節(jié)內(nèi)部的“炎癥風(fēng)暴”在破壞軟骨?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，一種叫WTAP的蛋白在患者關(guān)節(jié)里異常增多，它會給一個(gè)叫 FRZB 的“剎車基因”貼上RNA標(biāo)簽（m?A）讓這個(gè)“剎車”失效。

2024年1月4日，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院徐興全/蔣青研究團(tuán)隊(duì)在Experimental & Molecular Medicine雜志發(fā)表了“WTAP-mediated m6A modification of FRZB triggers the inflammatory response via the Wnt signaling pathway in osteoarthritis”揭示了WTAP介導(dǎo)的FRZB的m?A修飾通過Wnt信號通路觸發(fā)骨關(guān)節(jié)炎中的炎癥反應(yīng)。

越來越多的證據(jù)表明，RNA的N?-甲基腺苷（m?A）修飾在骨關(guān)節(jié)炎（OA）發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在多種m?A“寫入蛋白”中，Wilms腫瘤1相關(guān)蛋白（WTAP）在臨床OA軟骨中表達(dá)顯著升高并促進(jìn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。通過MeRIP-seq與RNA-seq聯(lián)合分析，研究人員鑒定出Wnt通路拮抗因子卷曲相關(guān)蛋白（FRZB）為關(guān)鍵下游靶點(diǎn)：其mRNA在OA軟骨中m?A修飾水平升高，導(dǎo)致表達(dá)顯著下調(diào)。WTAP通過m?A依賴的方式抑制FRZB，從而解除對Wnt/β-catenin信號通路的抑制，激活該通路并誘發(fā)軟骨損傷表型。

在小鼠OA模型中，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射AAV-WTAP反而緩解了疾病進(jìn)展，而這一保護(hù)作用可被Wnt/β-catenin通路激活劑逆轉(zhuǎn)，提示W(wǎng)TAP-FRZB軸在調(diào)控OA進(jìn)程中的核心地位。綜上，該研究揭示了WTAP介導(dǎo)的m?A修飾通過轉(zhuǎn)錄后抑制FRZB，異常激活Wnt/β-catenin通路驅(qū)動(dòng)OA發(fā)展，為靶向RNA表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控治療骨關(guān)節(jié)炎提供了新策略。

圖一 WTAP在TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)炎軟骨中表達(dá)上調(diào)

首先，作者檢測了臨床骨關(guān)節(jié)炎軟骨中主要m?A甲基化相關(guān)基因的表達(dá)，結(jié)果表明WTAP是唯一顯著上調(diào)的甲基轉(zhuǎn)移酶。

為構(gòu)建細(xì)胞水平的骨關(guān)節(jié)炎模型，使用促炎細(xì)胞因子TNF-α處理人軟骨細(xì)胞。隨后，通過軟骨基質(zhì)代謝相關(guān)基因和炎癥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)升高以及ADAMTS4、ADAMTS5和MMP13蛋白表達(dá)增加，證實(shí)了類骨關(guān)節(jié)炎表型的形成。此外，由于軟骨中活性氧（ROS）水平升高與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展相關(guān)，作者發(fā)現(xiàn)經(jīng)TNF-α刺激的軟骨細(xì)胞中ROS水平明顯上升。值得注意的是，用50 ng/ml TNF-α處理24小時(shí)的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的類骨關(guān)節(jié)炎表型，因此該條件被用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

接下來，在該細(xì)胞骨關(guān)節(jié)炎模型中進(jìn)一步檢測了主要m?A甲基化相關(guān)基因的表達(dá)。在經(jīng)50 ng/ml TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中，WTAP的mRNA表達(dá)上調(diào)最為顯著，同時(shí)作者也確認(rèn)了TNF-α處理后軟骨細(xì)胞中WTAP蛋白表達(dá)的升高。這些結(jié)果表明，WTAP在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中高表達(dá)，并可能在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

圖二 敲除WTAP可緩解骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的表型

為了評估WTAP在骨關(guān)節(jié)炎中的作用，作者將過表達(dá)WTAP的質(zhì)粒（flag-WTAP）轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞。經(jīng)過新霉素篩選24小時(shí)后，通過qRT-PCR和Western blotting確認(rèn)了WTAP的mRNA和蛋白水平顯著升高。免疫熒光檢測結(jié)果也顯示軟骨細(xì)胞中WTAP蛋白表達(dá)增加，且WTAP過表達(dá)后m?A甲基化水平升高。

為評估WTAP對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞表型的影響，作者檢測了ADAMTS4、ADAMTS5、MMP13、IL-6、IL-8和iNOS的mRNA表達(dá)水平以及ADAMTS4、ADAMTS5和MMP13的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)它們在WTAP過表達(dá)后均顯著升高。此外，與對照組相比，過表達(dá)WTAP的軟骨細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生也顯著增加。進(jìn)一步地，作者使用慢病毒轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞以敲除WTAP。

經(jīng)篩選后確定嘌呤霉素的最佳濃度為2.5 μg/mL。在轉(zhuǎn)染第七天，TNF-α處理對轉(zhuǎn)染效率無明顯影響。在TNF-α刺激下，WTAP敲除細(xì)胞模型中WTAP的mRNA和蛋白水平均顯著降低。免疫熒光結(jié)果也證實(shí)了WTAP慢病毒的有效轉(zhuǎn)染。敲除WTAP后，軟骨細(xì)胞中的m?A水平下降并顯著降低了骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達(dá)水平。此外，WTAP敲除還減弱了TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中活性氧的積累。

綜上所述，這些結(jié)果表明WTAP參與調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的表型。

圖三 抑制WTAP可通過失活Wnt/β-catenin信號通路緩解骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展

為了探究WTAP是否在體內(nèi)參與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，作者通過關(guān)節(jié)腔注射對照病毒或攜帶WTAP干擾序列的腺相關(guān)病毒（AAV siWTAP）至DMM誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中。敲低效率通過免疫組化得到驗(yàn)證。番紅O-快綠染色結(jié)果顯示，接受AAV siWTAP治療的小鼠軟骨表面損傷明顯改善，而對照組則無此效果。

OARSI評分的定量分析表明，對照組小鼠的OARSI評分顯著升高，而siWTAP治療組評分明顯降低。免疫組化結(jié)果進(jìn)一步顯示，AAV siWTAP注射可緩解骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型中軟骨基質(zhì)的退行性改變，包括分解代謝反應(yīng)減弱和細(xì)胞外基質(zhì)成分增加。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，siWTAP通過抑制FRZB表達(dá)使Wnt/β-catenin通路失活，從而改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨的降解。

此外，作者發(fā)現(xiàn)使用SKL2001激活Wnt/β-catenin信號通路可完全消除siWTAP對骨關(guān)節(jié)炎軟骨及OARSI評分的保護(hù)作用。還通過曠場實(shí)驗(yàn)（）和足跡分析進(jìn)一步證實(shí)了siWTAP對骨關(guān)節(jié)炎表型的抑制作用。值得注意的是，在主要器官的組織結(jié)構(gòu)中觀察到siWTAP和SKL2001具有良好的生物相容性。這些結(jié)果表明，β-catenin通路在WTAP促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨分解代謝改變及疾病發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

總結(jié)

本研究揭示了WTAP依賴的RNA m?A修飾水平升高會加劇骨關(guān)節(jié)炎軟骨的退變與疾病進(jìn)展。WTAP以m?A依賴的方式穩(wěn)定FRZB mRNA并激活骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路。作者的研究結(jié)果表明，WTAP介導(dǎo)的RNA m?A修飾失調(diào)可能是骨關(guān)節(jié)炎治療的一個(gè)有前景的干預(yù)靶點(diǎn)。

文章來源

https://doi.org/10.1038/s12276-023-01135-5

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