股骨頭壞死（osteonecrosis of the femoral head, ONFH）大鼠模型是研究該疾病發(fā)病機(jī)制、評(píng)估干預(yù)措施的重要工具。在大鼠的正常組中，對(duì)股骨頭的血管供應(yīng)進(jìn)行大體解剖并獲取圖像用于三維重建。采用微血管造影技術(shù)大鼠明確股骨頭周?chē)难芙馄式Y(jié)構(gòu)。

實(shí)驗(yàn)步驟

首先，經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，隨后打開(kāi)胸腔，切斷下腔靜脈（IVC）以充分放血。接著，通過(guò)插入左心室的針頭，以約120 mmHg的壓力灌注含肝素鈉（100 U/mL）的0.9%生理鹽水，沖洗血管系統(tǒng)。隨后，在相同壓力下灌注含放射性對(duì)比劑的硫酸鋇混懸液進(jìn)行血管造影固定。

完成灌注后，通過(guò)大體解剖觀察股骨頭的血管分布并取下股骨頭進(jìn)行顯微CT（micro-CT）掃描。采用micro-CT進(jìn)行微血管造影以清晰顯示股骨頭及其血供情況。沿縱軸共采集1024層CT圖像，分辨率高達(dá)9.41 μm（高分辨率模式）?；谠紨?shù)據(jù)對(duì)連續(xù)斷層圖像進(jìn)行三維重建。

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通過(guò)定位股骨頭周?chē)难芙Y(jié)構(gòu)，識(shí)別出三組主要供應(yīng)股骨頭骨骺的血管：前上支、后支和下支的圓韌帶動(dòng)脈。通過(guò)顯微鏡識(shí)別供應(yīng)股骨頭的前上支圓韌帶動(dòng)脈，并使用顯微外科器械和雙極電凝對(duì)其進(jìn)行逐一分離并電灼以誘導(dǎo)局部有效缺血，從而建立缺血性股骨頭壞死模型。手術(shù)采用改良的人類(lèi)全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)（THA）的直接前方入路，關(guān)節(jié)切開(kāi)后以9-0縫線縫合。僅對(duì)大鼠左側(cè)股骨頭進(jìn)行該手術(shù)。對(duì)照組則按相同方式暴露前上支圓韌帶動(dòng)脈，但不進(jìn)行電灼處理。每組分別在術(shù)后5周和10周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各處死5只大鼠并采集股骨頭用于后續(xù)分析。

正常大鼠股骨頭的血供主要由前上支、下支和后支圓韌帶動(dòng)脈共同供應(yīng)，其中前上支圓韌帶動(dòng)脈是股骨頭骨骺動(dòng)脈的主干

組織病理學(xué)分析

股骨頭樣本在進(jìn)行micro-CT掃描前，先以10%福爾馬林固定2天。掃描完成后，使用10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣3周。隨后將樣本石蠟包埋并切成5 μm厚的切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（H&E）染色。對(duì)股骨頭組織切片進(jìn)行盲法評(píng)估，選取連續(xù)3張切片進(jìn)行定性分析。通過(guò)觀察骨細(xì)胞陷窩內(nèi)是否存在細(xì)胞體或僅含固縮核，判斷陷窩是否為空；若在連續(xù)3張切片中均無(wú)完整細(xì)胞體，則判定為“空陷窩”。

Micro-CT分析

股骨頭使用micro-CT系統(tǒng)掃描，參數(shù)設(shè)置為：電壓80 kV，電流500 μA。自動(dòng)測(cè)量松質(zhì)骨相關(guān)參數(shù)，包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁間距（Tb.Sp）。分析區(qū)域?yàn)楣晒穷^骨骺部松質(zhì)骨，在冠狀面手動(dòng)勾畫(huà)ROI。每例樣本取多個(gè)層面測(cè)量值的平均值作為最終結(jié)果。此外，在micro-CT中軸冠狀面上測(cè)量股骨頭骨骺的高度與寬度，計(jì)算其高寬比以評(píng)估股骨頭變形程度：比值越低，塌陷越嚴(yán)重。

參考文獻(xiàn)

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• Qiu X, Shi X, Ouyang J, Xu D, Zhao D. A method to quantify and visualize femoral head intraosseous arteries by micro-CT. J Anat. 2016;229(2):326–333. doi: 10.1111/joa.12475.

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