撰文 |咸姐

在哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程中，多能性細胞經歷了一系列復雜而有序的形態(tài)發(fā)生事件，這一過程對人類生命起源的理解至關重要。全能性的合子經過卵裂形成內細胞團，在著床后，內細胞團中的原始外胚層細胞會發(fā)生根本性轉變：它們從相對無序的細胞團，自組織形成一個具有頂-基極性的柱狀上皮結構，并圍繞著一個管腔（未來的羊膜腔）排列。這個上皮化的外胚層是后續(xù)發(fā)育的基石，它將暫時維持多能性，直到原腸運動開始。在原腸運動期間，外胚層上皮中的一部分細胞會經歷上皮-間質轉化（EMT），失去上皮特性并獲得遷移能力，從而形成原條 （P S ） ，并最終產生胚胎的三個胚層。因此，外胚層從上皮身份的建立到部分細胞的上皮特性喪失，是胚胎模式形成和細胞命運決定的關鍵轉折點【1,2】。

然而，在人類發(fā)育中，究竟是哪些信號分子誘導并維持了著床后外胚層（PostEpi）的上皮身份？上皮身份的維持與細胞多能性狀態(tài)是緊密耦聯(lián)還是彼此獨立的過程？這些問題在很大程度上仍然是未知的。這主要是由于對人類著床后胚胎進行研究面臨著嚴峻的倫理約束和技術壁壘。傳統(tǒng)的二維人多能干細胞培養(yǎng)體系雖然模擬了著床后外胚層的某些分子特征，但無法重現(xiàn)胚胎的三維結構和細胞間相互作用的復雜性，因而難以捕捉調控上皮極化和組織形態(tài)發(fā)生的完整信號網絡。近年來，科學家們開發(fā)了多種三維胚胎模型來模擬早期發(fā)育，這些模型極大地增進了我們對某些發(fā)育事件（如管腔形成）的理解。然而，這些模型往往在復雜性與效率/可重復性之間存在權衡，且細胞類型異質性和培養(yǎng)成分的不確定性為精準解析特定發(fā)育過程的分子調控機制帶來了挑戰(zhàn)。例如， TGFβ超家族信號（包括TGFβ、Activin、NODAL等）在人類上胚層發(fā)育中的具體作用一直存在爭議：這些信號分子既被報道可維持多能性，又被發(fā)現(xiàn)能誘導EMT和原條形成，其雙重功能如何時空協(xié)調仍不清楚。 因此，開發(fā)一個化學成分明確、高效且可重復的三維人類胚胎著床后外胚層模型，對于揭示調控上皮身份建立和原條形成的分子機制至關重要【3,4】。

近日，來自意大利 帕多瓦大學的Graziano Martello團隊在Nature Cell Biology上在線發(fā)表題為A human epiblast model reveals dynamic TGFβ-mediated control of epithelial identity during mammalian epiblast development的文章，開發(fā)了一種化學成分確定的三維模型，使多能干細胞自組織形成具有管腔的柱狀上皮，并自發(fā)產生原條樣細胞。這一模型的成功建立，為在體外深入探究人類胚胎著床后上皮身份的調控機制，特別是TGFβ超家族信號在這一動態(tài)過程中可能扮演的、此前未被充分認識的復雜角色，提供了一個強大、可靠且可進行高通量分析的研究平臺。通過結合該模型與小鼠胚胎模型及體內實驗驗證，本研究揭示了一個在進化上保守的、動態(tài)調控多能性外胚層上皮身份的分子開關。

本文研究人員 通過對人類及小鼠胚胎單細胞轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，識別出上皮化過程的關鍵標記物變化，并基于此設計了一種明確含有TGFβ1、FGF2和 I NSULIN （三條在 PostEpi 階段處于活躍狀態(tài)的通路的配體 ） 的培養(yǎng)基體系 （E 8 ），然后 將H9胚胎干細胞或KiPS誘導多能干細胞接種于基質膠上，最終高效地形成了具有管腔的柱狀上皮囊腫。單細胞轉錄組分析證實，這些囊狀結構包含轉錄譜與體內著床后外胚層高度一致的“PostEpi樣”細胞群，以及后續(xù)自發(fā)產生的表達原條標記物的“PS樣”細胞群。值得注意的是，體外模型中細胞的偽時間發(fā)育軌跡清晰地展現(xiàn)了從二維多能態(tài)向PostEpi樣狀態(tài)（上調上皮和極性基因）以及向PS樣狀態(tài)（上調間質和原條基因）轉化的兩條路徑。該模型被命名為“3D-hE-gastruloids”，它高效地再現(xiàn)了外胚層上皮形成、管腔發(fā)生以及原條樣細胞產生的關鍵發(fā)育事件，為后續(xù)機制研究提供了可重復且可控的實驗平臺。

隨后， 研究人員系統(tǒng)性地阻斷 E 8培養(yǎng)基中的關鍵信號通路， 發(fā)現(xiàn)撤除I NSULIN會導致細胞死亡，阻斷FGF通路主要影響結構大小和存活，而抑制TGFβ家族信號（使用抑制劑SB43或A83，或通過CRISPRi敲低SMAD2）則不會影響細胞存活，但會嚴重破壞細胞自組織過程 —— 三維結構失去典型的柱狀形態(tài)，頂端的F-肌動蛋白極性消失，上皮標志物（如CDH1、ESRP1）表達下調，間質標志物（如CDH2、VIM）則上調。時序實驗表明，TGFβ1信號僅在上皮形成的起始階段（培養(yǎng)的前2天）是必需的，此時抑制信號會徹底阻止上皮化；一旦上皮結構建立后（2天后），抑制信號對其維持則無顯著影響。 這些結果 證明TGFB1通過SMAD2依賴的經典通路，在3D-hE-gastruloids形成的最初48小時內驅動多能干細胞獲得并穩(wěn)固柱狀上皮身份，且此功能獨立于其對多能性標志物的持續(xù)調控作用。

為驗證TGFβ家族信號調控外胚層上皮自組織在進化上的保守性，研究 人員 在三種不同的小鼠體外模型中檢驗了其功能。首先，在僅由小鼠初始態(tài) 胚胎干細胞（ ES ） 嵌入基質膠形成的“ rosette ”結構中，抑制該信號會破壞上皮組織和管腔形成。其次，在由野生型和誘導表達Gata4的ES細胞混合形成的囊狀結構（無需外源細胞外基質）中，抑制信號同樣導致管腔發(fā)生和細胞極化完全缺失。最后，在更為復雜的“ETIX胚胎樣體”（由ES細胞、滋養(yǎng)層干細胞和誘導表達GATA4的ES細胞構成）中，信號抑制雖不影響早期細胞聚集，但嚴重破壞了后續(xù)的卵圓柱體自組織、原羊膜腔形成及結構伸長，并伴隨多能性標志物表達的喪失。三個不同復雜度模型的實驗結果一致表明，無論是否存在外源性基質或胚外細胞，TGFβ家族信號對于促進小鼠多能性外胚層細胞在體外自組織形成極化上皮結構都是必需的，這提示了該調控機制在哺乳動物中的廣泛保守性。 與此同時，研究人員還在 體內胚胎水平 證明， TGFβ家族信號對于小鼠著床后早期胚胎中外胚層極化上皮的自組織、管腔形成以及多能性的維持是必需的 ， 經A83 抑制劑 處理的 小鼠 胚胎發(fā)生了嚴重紊亂 —— 外胚層上皮失去正常結構、原羊膜腔無法形成、OCT4表達顯著降低，同時F-肌動蛋白和極性蛋白PODXL的分布變得雜亂無章 ， 胚胎存在伸長缺陷和尺寸減小 。

進一步地，研究人員發(fā)現(xiàn)， ZNF398是TGFβ1信號通路實現(xiàn)其促上皮功能的關鍵下游效應因子，它對于建立和維持外胚層的上皮身份既是必需的也是充分的，但其功能與多能性的維持相對獨立。 深入研究則證實， ZNF398通過直接激活上皮相關基因程序并同時抑制間質相關基因程序，來協(xié)同穩(wěn)固上皮細胞身份。ZNF398的抑制導致多能性和上皮基因下調，同時上調間質和神經前體基因。ZNF398結合在大量受其調控的基因調控區(qū)域，特別是增強子區(qū)，并表現(xiàn)出同時激活和抑制基因表達的雙重功能。通過整合其結合譜與功能喪失和功能獲得實驗數(shù)據(jù)，研究 人員 鑒定出一組受ZNF398直接調控的核心靶基因 ， 包括被激活的上皮主調控因子ESRP1和緊密連接組分基因CGN，以及被抑制的關鍵EMT誘導因子ZEB2和間質標志物CDH2（圖1）。 與此同時，研究人員 探討了在 3 D上皮結構形成后，TGFβ家族的另一成員ACTIVIN信號對原條分化的影響 。研究發(fā)現(xiàn)， 單獨添加Activin A即可高效誘導原條標記物（MIXL1、TBXT）的表達和GFP陽性間質細胞的出現(xiàn)，其效果甚至優(yōu)于包含BMP4、FGF和LY的混合誘導方案，且該誘導能力顯著強于 2 D培養(yǎng)條件。單細胞轉錄組分析證實，Activin A處理能從分子水平上將上皮樣細胞高效轉變?yōu)榫哂械湫驮瓧l轉錄特征的細胞。此外，對比分析表明，形成的PS樣細胞高表達Activin/Nodal受體而低表達TGFβ受體，這可能解釋了為何在結構形成后TGFβ1無法誘導、而Activin卻能高效誘導原條分化的現(xiàn)象。這些結果揭示了TGFβ家族信號在 3 D外胚層模型中具有動態(tài)的雙重功能 —— 早期TGFβ1信號促進上皮身份建立，而上皮建立后，ACTIVIN信號則能高效啟動上皮-間質轉化和原條分化。

圖1

綜上所述， 本研究成功構建了一個化學定義的 3 D人類外胚層模型（3D-hE-gastruloids），在沒有胚外細胞參與的情況下，成功復現(xiàn)了著床后外胚層發(fā)育的關鍵特征。這表明，基底膜以及由FGF2、INSULIN和TGFB1介導的信號刺激，是鞏固著床后外胚層身份并啟動原條誘導的最基本條件。通過整合該模型、多種小鼠體外模型及體內胚胎實驗，研究系統(tǒng)揭示了TGFβ家族信號動態(tài)且保守地調控哺乳動物多能性外胚層上皮身份的核心機制 ， 闡明了同一信號家族在時間與空間上協(xié)調截然不同的細胞命運轉變 的重要過程 。

https://doi.org/10.1038/s41556-025-01831-6

制版人： 十一

參考文獻

1. Boroviak, T. & Nichols, J. The birth of embryonic pluripotency.Philos. Trans. R. Soc. Lond. B369, 20130541 (2014).

2. Sheng, G., Martinez Arias, A. & Sutherland, A. The primitive streak and cellular principles of building an amniote body through gastrulation.Science374, abg1727 (2021).

3. Pedroza, M. et al. Self-patterning of human stem cells into post-implantation lineages.Naturehttps://doi.org/10.1038/s41586-023-06354-4 (2023).

4. Zheng, Y. et al. Controlled modelling of human epiblast and amnion development using stem cells.

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