原文發(fā)表于《科技導(dǎo)報》2025 年第23 期 《 基于極端微生物代謝工程與合成生物學的“下一代生物制造技術(shù)” 》

為實現(xiàn)“雙碳”目標，工業(yè)生物制造需向綠色可持續(xù)轉(zhuǎn)型。高耗水、高滅菌能耗及工藝不連續(xù)等瓶頸推動了以極端微生物為核心的下一代生物制造技術(shù)的發(fā)展。《科技導(dǎo)報》邀請清華大學合成與系統(tǒng)生物學中心、生命科學學院、化工系、綠色生物制造全國重點實驗室陳國強教授等撰文，文章綜述了鹽單胞菌作為核心底盤的應(yīng)用價值與技術(shù)進展，提出了未來需著力開發(fā)通用性更強的合成生物學工具，提升規(guī)模化發(fā)酵過程的穩(wěn)定性，強化碳源預(yù)處理與工藝環(huán)節(jié)的整合度。

近年來，合成生物學的發(fā)展進一步推動了微生物生物制造在多樣化產(chǎn)品生產(chǎn)中的應(yīng)用研究，并引領(lǐng)了下一代技術(shù)的探索。相較于常規(guī)微生物底盤，極端微生物憑借其在嚴苛環(huán)境中突出的生長能力，展現(xiàn)出顯著的抗染菌、可連續(xù)過程和低成本的生產(chǎn)潛力，尤其適用于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)各種生物產(chǎn)品（表1）。基于極端微生物代謝工程與合成生物學改造的下一代生物制造技術(shù)，不僅有望顯著簡化工藝過程，支撐以低成本原料為底物、無需滅菌的開放式連續(xù)發(fā)酵，更進一步彰顯了其成為可持續(xù)制造領(lǐng)域核心綠色解決方案的潛力。

表1 極端微生物在嚴苛環(huán)境中突出的生長能力及其應(yīng)用

01

極端微生物開啟生物制造新時代

1.1 生物制造代際躍遷的需求

利用微生物作為“細胞工廠”的生物制造技術(shù)，憑借其環(huán)境友好特性，正日益成為生產(chǎn)多樣化的化學品的重要替代方案，并受到廣泛關(guān)注。得益于合成生物學的快速發(fā)展，生物制造在生物燃料、生物材料、食品添加劑等多種化學品生產(chǎn)領(lǐng)域已展現(xiàn)出與傳統(tǒng)制造相當?shù)母偁幜?，呈現(xiàn)出未來替代傳統(tǒng)石油基生產(chǎn)路徑的趨勢。

然而，以常規(guī)微生物及各類酵母為基礎(chǔ)的當前工業(yè)生物技術(shù)（CIB），其規(guī)?；瘧?yīng)用仍受限于幾個關(guān)鍵瓶頸：為防控雜菌污染所必需的高能耗滅菌過程、難以實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)導(dǎo)致效率低下，以及由此帶來的成本競爭力不足。

為突破這些限制，以極端微生物為底盤菌株的下一代生物制造（NGIB）應(yīng)運而生。這一策略顯著降低了滅菌能耗、簡化了操作流程（尤其是淡水資源的消耗），并提高了生產(chǎn)的連續(xù)性。得益于針對此類極端微生物開發(fā)的遺傳操作工具箱，NGIB平臺已成功用于高效合成多種產(chǎn)品。

1.2 極端微生物的工業(yè)價值潛力

極端微生物指能夠在高鹽度、極端pH值、高溫或高壓等惡劣環(huán)境中生存的微生物，主要為原核細菌和古菌。根據(jù)其耐受的主要環(huán)境條件，它們被命名為嗜酸菌、嗜堿菌、嗜鹽菌、嗜熱菌和嗜旱菌等。部分菌株甚至具備多重環(huán)境耐受性（表1）。目前，極端微生物的應(yīng)用主要集中于嗜熱菌（生長溫度>50℃）、嗜酸堿菌和嗜鹽菌這3大類群，呈現(xiàn)“三足鼎立”之勢。其中：

• 嗜熱菌因其高溫生長特性，在發(fā)酵過程中可顯著節(jié)省冷卻成本并有效防止雜菌污染。

• 嗜酸堿菌在極端pH值條件下生長具有天然的抗雜菌污染優(yōu)勢。

• 嗜鹽菌的高鹽適應(yīng)性使其在開放培養(yǎng)體系中大幅減少滅菌需求，有效降低生產(chǎn)成本，因此在可持續(xù)生物制造領(lǐng)域備受關(guān)注。

02

基于鹽單胞菌開發(fā)的“下一代工業(yè)生物技術(shù)”

鹽單胞菌Halomonas bluephagenesis TD01分離自新疆艾丁湖，是一株可天然合成生物聚酯PHB的嗜鹽菌。顯著優(yōu)勢有：

• 耐受高鹽高堿環(huán)境，抗雜菌污染能力強；

• 其野生型菌株在優(yōu)化的葡萄糖礦物質(zhì)培養(yǎng)基中可高效積累PHB；

• 且細胞壁在低滲條件下易破裂，便于下游產(chǎn)物提取。

2.1 基因工程

在遺傳操作的核心工具方面，鹽單胞菌主要依賴3類載體系統(tǒng)：基于標準歐洲載體架構(gòu)（SEVA）的pSEVA系列載體、經(jīng)改造的pRE112?pMB1載體，以及基于天然毒素?抗毒素模塊構(gòu)建的無抗生素表達系統(tǒng)pHbPBC。調(diào)控基因表達的關(guān)鍵在于啟動子工程，該菌株中已成功開發(fā)出多種啟動子工具。特別值得指出的是，強效的低氧誘導(dǎo)啟動子Pvgb及其工程化串聯(lián)版本P8vgb，顯著提升了該菌在微好氧條件下生產(chǎn)多種生物聚酯PHA的能力。核糖體結(jié)合位點（RBS）的優(yōu)化則借助在線計算工具和RNA測序（RNA?seq）技術(shù)實現(xiàn)，而終止子工程則開發(fā)了高效的不依賴Rho因子的終止子。

基因組編輯技術(shù)的進步極大推動了代謝途徑的精準改造。在該菌中，編輯策略已從早期基于I?SceI內(nèi)切酶介導(dǎo)的雙交換，發(fā)展至高效的CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用，基于小分子RNA（sRNA，如 PrrF1?2?HfqPa）的調(diào)控系統(tǒng)也能有效下調(diào)靶基因，顯著改變產(chǎn)物的組成。提升遺傳轉(zhuǎn)化效率是重要挑戰(zhàn)，利用大腸桿菌S17?1進行接合轉(zhuǎn)移是常用方法。

適應(yīng)性進化是增強宿主性能的有效策略。盡管傳統(tǒng)蛋白質(zhì)定向進化在鹽單胞菌中應(yīng)用有限，近期開發(fā)的革命性正交轉(zhuǎn)錄突變系統(tǒng)（OTM）融合了噬菌體RNA聚合酶和脫氨酶功能，實現(xiàn)了超快速（1 天）、高效率（突變率提升150萬倍）的體內(nèi)蛋白質(zhì)進化，為未來代謝途徑的深度優(yōu)化開辟了新途徑（表2）。

綜上所述，基于鹽單胞菌所開發(fā)的技術(shù)已發(fā)展出一套綜合體系，集成了精細的遺傳元件設(shè)計、多樣化的基因組編輯工具以及高效的宿主進化策略（圖1）。

表2 基于鹽單胞菌所開發(fā)的技術(shù)

圖1 基于鹽單胞菌所開發(fā)的技術(shù)

2.2 代謝工程

代謝流調(diào)控是極端微生物代謝工程的核心挑戰(zhàn)。因此，除了傳統(tǒng)的篩選、工程化與優(yōu)化策略，還需要協(xié)同開發(fā)多種代謝工程方法，以強化目標產(chǎn)物的代謝通量，提升鹽單胞菌在生物制造中的產(chǎn)出。優(yōu)化細胞形態(tài)是提高產(chǎn)物積累的有效策略。在鹽單胞菌中，通過基因工程擴大細胞體積已被證實能有效促進PHA的積累。此外，更為精細的調(diào)控策略也已開發(fā)，例如改造ClpXP蛋白降解系統(tǒng)，實現(xiàn)了對目標蛋白（如MreB）降解速率的動態(tài)、可調(diào)控降解，為精確控制細胞形態(tài)提供了新工具。

革蘭氏陰性菌的外膜結(jié)構(gòu)在維持細胞完整性、降低通透性方面構(gòu)成關(guān)鍵屏障。這些工程菌株表現(xiàn)出增強的細胞通透性，這不僅提高了異丙基?β?D?硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)的靈敏度，還增強了菌株在低氧條件下的適應(yīng)性，增加了對抗生素的敏感性，改善了胞內(nèi)氧氣攝取效率，并促進了相容性溶質(zhì)四氫嘧啶的外泌。更重要的是，這些改造顯著提升了細胞干重、PHA含量以及PHA的轉(zhuǎn)化效率。最近，為降低PHA下游提取成本，在不同工程化的H. bluephagenesis菌株中應(yīng)用了胞外多糖（EPS）缺陷策略，通過刪除特定的EPS合成基因片段（如PS1、PS2和PS4）。利用這些EPS敲除細胞進行發(fā)酵，有效減少了底物消耗，降低了能量需求，并顯著簡化了下游提取流程。

細胞內(nèi)氧化還原環(huán)境的平衡是影響代謝物（尤其是PHA）高效積累的另一個決定性因素。為了在限氧條件下提升NADH/NAD+比值并促進PHA積累，可以靶向調(diào)節(jié)電子傳遞鏈。這一氧化還原工程策略使細胞干重中的PHB含量達到了90%，顯著超越了野生型菌株84%的PHA含量。利用外源添加乙酸來平衡NADH/NAD+比值也被證明是有效的策略。氧化還原平衡策略同樣適用于其他高附加值化學品的生產(chǎn)。

創(chuàng)新性調(diào)控系統(tǒng)的開發(fā)極大地推動了PHA生產(chǎn)的自動化和經(jīng)濟性。通過對H. bluephagenesis TD菌株進行代謝工程改造，開發(fā)了一種基于PHA合成相關(guān)蛋白PhaR和PhaP1的自誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。該策略構(gòu)建了一個“自激勵”的生產(chǎn)系統(tǒng)，能夠在無需添加昂貴外源誘導(dǎo)劑（如IPTG）的條件下實現(xiàn)PHB的高效合成。深入研究表明，PhaR蛋白在這一過程中扮演著核心調(diào)控角色。這種精妙的自我調(diào)控機制顯著提高了PHA產(chǎn)量，并簡化了生產(chǎn)工藝，大幅降低了成本。為了進一步解決PHA生產(chǎn)中下游提取成本高昂的瓶頸問題，在鹽單胞菌中成功構(gòu)建了一套智能自裂解系統(tǒng)。該系統(tǒng)首創(chuàng)性地使用PHA感應(yīng)型的PhaP1啟動子進行調(diào)控，自動觸發(fā)裂解基因的表達。同時，通過優(yōu)化裂解基因前的RBS，最大限度地減少其對宿主細胞PHA合成能力的干擾。這些突破性進展為PHA的工業(yè)化生產(chǎn)尤其是提純帶來了顯著的經(jīng)濟效益。

綜上所述，通過對極端微生物鹽單胞菌進行多層次的工程改造，以及開發(fā)智能的自誘導(dǎo)和自裂解系統(tǒng)，這些工作成功開發(fā)出一系列具有顯著工業(yè)應(yīng)用價值的下一代生物制造技術(shù)方案。這些系統(tǒng)性工程策略有效克服了PHA生產(chǎn)成本高昂的障礙，極大地推動了PHA生物可降解材料的商業(yè)化進程，充分展示了極端微生物代謝工程在可持續(xù)生物制造領(lǐng)域的廣闊應(yīng)用前景。

03

基于鹽單胞菌的生物制造應(yīng)用開發(fā)

3.1 鹽單胞菌生產(chǎn)PHA和小分子化合物

鹽單胞菌能夠高效合成2類關(guān)鍵產(chǎn)品：生物可降解材料PHA及多種高附加值化學品，為可持續(xù)工業(yè)生物技術(shù)提供了獨特平臺（圖2）。

在生物材料領(lǐng)域，PHA作為胞內(nèi)積累的聚酯，因其優(yōu)異的生物相容性、可降解性及材料可塑性，被視為石油基塑料的綠色替代品。鹽單胞菌天然具備PHA合成能力，通過代謝工程強化，整合外源phaAB基因可使PHB產(chǎn)量提升至細胞干重的76%。更重要的是，菌株改造已突破均聚物限制，成功生產(chǎn)含3?羥基丙酸（3HP）、4?羥基丁酸（4HB）、5?羥基戊酸（5HV）等單體的共聚物，顯著拓展材料性能譜。為降低生產(chǎn)成本，工程策略聚焦底物多元化：利用淀粉、木質(zhì)纖維素水解物、餐廚廢料水解物等廉價碳源，并通過途徑重定向?qū)崿F(xiàn)葡萄糖至PHA共聚物P(3HB?co?4HB)的直接合成。200-400立方米生物反應(yīng)器規(guī)?；a(chǎn)驗證了其工業(yè)可行性。

圖2 用于生產(chǎn)多種生物制品的嗜鹽微生物細胞工廠的設(shè)計

高值化學品的生物合成是鹽單胞菌另一核心應(yīng)用方向。氨基酸類產(chǎn)物中，四氫嘧啶作為高端化妝品與醫(yī)藥原料，在H. bluephagenesis中實現(xiàn)與PHB聯(lián)產(chǎn)。有機酸領(lǐng)域亮點突出：3?羥基丙酸（3HP）產(chǎn)量達154 g/L，衣康酸作為可再生平臺化學品通過全細胞催化實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化，甲羥戊酸（MVA）作為類異戊二烯前體產(chǎn)量達121 g/L。此外，γ?氨基丁酸（GABA）通過全細胞催化實現(xiàn)880 g/L超高產(chǎn)量，凸顯其生物催化潛力。

鹽單胞菌在蛋白質(zhì)生產(chǎn)領(lǐng)域同樣展現(xiàn)獨特價值，其胞內(nèi)積累的四氫嘧啶可穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，而天然分泌系統(tǒng)支持重組酶表達。此外，該菌屬作為嗜鹽酶資源庫，提供耐極端條件的水解酶與氧化還原酶，適用于制藥、食品工業(yè)。

創(chuàng)新應(yīng)用方向正在拓展：PHA可酯化為生物燃料（如R?3?羥基丁酸甲酯），而H. bluephagenesis已實現(xiàn)丙烷、PHB與扁桃酸酯聯(lián)產(chǎn)。色素生產(chǎn)方面，工程化H. elongata的β?胡蘿卜素產(chǎn)量達560μg/g干重。

綜上所述，鹽單胞菌通過多層次代謝工程，已發(fā)展成為兼具“生物材料工廠”與“高值化學品合成平臺”雙重功能的超級微生物底盤（圖2）。其在開放連續(xù)發(fā)酵、底物廣譜利用及產(chǎn)品多元聯(lián)產(chǎn)方面的獨特優(yōu)勢，為降低生物制造成本、推動循環(huán)經(jīng)濟提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。

3.2 鹽單胞菌的廢棄物資源化利用

鹽單胞菌通常以葡萄糖為主要碳源，但部分菌株可天然利用非常規(guī)底物。然而，工業(yè)潛力突出的菌株因缺乏胞外酶分泌能力，難以利用復(fù)雜底物，需通過代謝工程改造解決。

針對淀粉利用，研究者改造H. bluephagenesis使其分泌淀粉酶和葡萄糖苷酶，成功以玉米淀粉為碳源合成PHA、PHB、PHBV、P34HB及四氫嘧啶等產(chǎn)物，搖瓶中細胞干重（CDW）達10 g/L，PHB含量占51%。木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物木糖的利用亦獲突破：通過引入木糖轉(zhuǎn)運蛋白、異構(gòu)酶及磷酸酮醇酶途徑，工程化H. bluephagenesis的PHB產(chǎn)量提升至5.37 g/L（CDW 8.81 g/L）。

餐廚垃圾的資源化利用是另一重點。工程化H. bluephagenesis在細胞外膜合成基因ompW啟動子驅(qū)動下過表達PHA操縱子，以富氮食物垃圾水解液為原料，在7?L生物反應(yīng)器中CDW達70 g/L，PHB含量占80%。針對低成本底物乙酸，通過適應(yīng)性實驗室進化獲得耐受性菌株H. bluephagenesis B71，進一步引入甲羥戊酸途徑并結(jié)合非氧化糖酵解設(shè)計，使MVA產(chǎn)量達121 g/L。

CO2固定技術(shù)為碳中和提供新思路。值得注意的是，部分鹽單胞菌（例如H. rowanensis）通過還原性三羧酸（rTCA）循環(huán)而非卡爾文循環(huán)實現(xiàn)化能自養(yǎng)，以硫代硫酸根為能源，其獨特CO2同化機制的闡明將對工業(yè)應(yīng)用產(chǎn)生深遠影響。

04

“下一代生物制造技術(shù)”的產(chǎn)業(yè)實踐

NGIB作為當前工業(yè)生物技術(shù)的重大升級與創(chuàng)新方向，其核心優(yōu)勢在于利用極端微生物（如鹽單胞菌）作為底盤細胞進行生物制造。這些微生物能在高鹽等極端環(huán)境下生長，從根本上消除了傳統(tǒng)發(fā)酵過程中復(fù)雜且高能耗的滅菌步驟需求，實現(xiàn)了開放發(fā)酵。這一特性賦予了NGIB顯著的優(yōu)勢：高底物轉(zhuǎn)化率、低能耗、節(jié)水以及環(huán)境友好性（因其產(chǎn)生的廢水量少且可回收利用）。此外，通過工程技術(shù)（如增大細菌體積或調(diào)整表面電荷）誘導(dǎo)微生物發(fā)生自絮凝沉降，NGIB極大地簡化了產(chǎn)物的下游分離純化過程（圖3）。

圖3 基于鹽單胞菌的下一代工業(yè)生物技術(shù)流程

NGIB技術(shù)已成功應(yīng)用于多種高價值產(chǎn)品的生產(chǎn)，特別是生物可降解材料PHA以及各類精細化學品。隨著合成生物學工具的快速發(fā)展及其在鹽單胞菌工程化中的應(yīng)用，NGIB的優(yōu)勢不斷被強化和完善，并已在中國實現(xiàn)工業(yè)化。其中，微構(gòu)工場專注于工業(yè)發(fā)酵，尤其是在PHA生產(chǎn)和鹽單胞菌應(yīng)用方面處于國際前沿，已成功建成全球首個萬噸級PHA生產(chǎn)線。為進一步擴大規(guī)模，微構(gòu)工場與安琪酵母（Angel Yeast）合作建立合資企業(yè)，產(chǎn)品線涵蓋PHA顆粒、吸管、注塑餐具、淋膜紙杯、3D打印材料和醫(yī)藥中間體等多元化終端應(yīng)用（圖4）。綜上所述，憑借其高效、節(jié)能、節(jié)水和環(huán)境友好的核心特點，NGIB正迅速發(fā)展成為工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域至關(guān)重要的未來方向。

圖4 國內(nèi)部分PHA企業(yè)發(fā)展歷程

05

結(jié)論

極端微生物特別是鹽單胞菌，正成為下一代生物制造的重要生產(chǎn)平臺。這類微生物具有獨特的環(huán)境適應(yīng)能力，其強大的抗污染特性尤為突出，使得在開放環(huán)境下進行非滅菌發(fā)酵成為可能，顯著降低了生產(chǎn)能耗與成本。

未來突破需系統(tǒng)整合前沿技術(shù)、智能裝備與政策支持。技術(shù)層面亟需開發(fā)高效菌種篩選技術(shù)，構(gòu)建跨物種基因表達載體，優(yōu)化CRISPR等基因編輯工具的多位點編輯能力，建立從基因序列到生理功能的預(yù)測模型，設(shè)計耐受嚴酷環(huán)境的遺傳元件，并統(tǒng)一代謝分析標準。產(chǎn)業(yè)實施路徑應(yīng)包含：建立代謝模型指導(dǎo)產(chǎn)物合成路線設(shè)計，拓展工農(nóng)業(yè)廢棄物等替代原料的應(yīng)用，采用智能生物反應(yīng)器實現(xiàn)精準工藝調(diào)控。依托中國“雙碳”政策支持，通過發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟模式推進廢棄物資源化利用，構(gòu)建完整產(chǎn)業(yè)生態(tài)鏈。隨著關(guān)鍵技術(shù)瓶頸的突破與產(chǎn)業(yè)生態(tài)的成熟，基于極端微生物的下一代生物制造技術(shù)將在全球綠色制造體系中發(fā)揮重要作用，為可持續(xù)發(fā)展提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。

本文作者：陳江楠、陳國強

作者簡介：陳江楠，清華大學生命科學學院，博士研究生，研究方向為合成生物學；陳國強（通信作者），清華大學生命科學學院，清華大學化學工程系，清華大學合成與系統(tǒng)生物學中心，清華北大生命中心，綠色生物制造全國重點實驗室，教授，研究方向為工業(yè)生物技術(shù)、微生物聚羥基脂肪酸酯的合成與應(yīng)用。

文章來 源 ： 陳江楠, 陳國強. 基于極端微生物代謝工程與合成生物學的“下一代生物制造技術(shù)”[J]. 科技導(dǎo)報, 2025, 43(23): 70?82 .

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