摘要：包膜病毒的跨膜糖蛋白是中和抗體的靶點(diǎn)和疫苗核心抗原，傳統(tǒng)研究多依賴可溶性蛋白，難以還原其天然狀態(tài)。本文研發(fā)的病毒糖蛋白納米盤平臺，能將跨膜糖蛋白組裝進(jìn)脂質(zhì)納米碟，實(shí)現(xiàn)了SPR親和力檢測、FACS B細(xì)胞分選和冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析的全流程應(yīng)用。以HIV MPER靶向疫苗為核心研究對象，解析了3.5?分辨率的免疫原-抗體復(fù)合物結(jié)構(gòu)，還成功應(yīng)用于埃博拉病毒糖蛋白研究，為下一代疫苗的理性設(shè)計提供了高效、通用的工具。一、疫苗研發(fā)的痛點(diǎn)：跨膜抗原研究的傳統(tǒng)困境

研發(fā)包膜病毒疫苗，跨膜糖蛋白是繞不開的核心，這類蛋白也是中和抗體識別的關(guān)鍵靶點(diǎn)。mRNA-LNP技術(shù)能在體內(nèi)表達(dá)天然的跨膜糖蛋白，但體外研究中，科研人員只能通過截斷跨膜域獲得可溶性蛋白，這會丟失膜近端外部區(qū)域（MPER）等關(guān)鍵表位。而MPER正是HIV、流感等病毒疫苗研發(fā)的重要靶點(diǎn)，天然脂質(zhì)環(huán)境的缺失，也讓糖基化修飾、蛋白構(gòu)象的研究與真實(shí)情況偏差較大。傳統(tǒng)方法的局限，成了疫苗理性設(shè)計的一大阻礙。

二、核心突破：標(biāo)準(zhǔn)化的糖蛋白納裝流程

我們搭建了一套可規(guī)模化、高重復(fù)性的納米盤組裝工作流，從細(xì)胞轉(zhuǎn)染到純化出成品僅需5天，1L細(xì)胞能獲得100-700μg純糖蛋白納米盤，足夠完成多次實(shí)驗(yàn)檢測。核心是將細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白用去污劑提取后，結(jié)合MSP1D1支架蛋白和脂質(zhì)分子，在親和基質(zhì)上完成“批量組裝”，最終得到的納米碟能在4℃穩(wěn)定保存3個月以上。以HIV Env gp151為基礎(chǔ)構(gòu)建了多款納米盤載體，還為埃博拉病毒糖蛋白適配了相同組裝條件，驗(yàn)證了平臺的通用性。

三、SPR多模態(tài)檢測：精準(zhǔn)測量抗體-抗原結(jié)合動力學(xué)

表面等離子體共振（SPR）是疫苗設(shè)計中檢測抗體親和力的核心手段，我們?yōu)榧{米盤平臺開發(fā)了三種SPR檢測模式，適配不同的實(shí)驗(yàn)需求。模式A能測單價Fab的真實(shí)親和力，模式B降低了抗體多價效應(yīng)的干擾，模式C則是高通量初篩的高效選擇，能最大程度節(jié)省樣品。用該平臺檢測HIV MPER靶向抗體10E8，發(fā)現(xiàn)工程化后的Env gp151 MPER ND能讓10E8親和力提升70倍，核心原因是解離速率大幅降低；對埃博拉糖蛋白納米盤的檢測也證實(shí)，該平臺能精準(zhǔn)區(qū)分抗原特異性抗體的結(jié)合能力。

四、FACS分選：捕捉疫苗免疫后的特異性B細(xì)胞

疫苗免疫后的B細(xì)胞分選與分析，是研究抗體應(yīng)答的關(guān)鍵，傳統(tǒng)可溶性探針無法識別膜近端表位的特異性B細(xì)胞。我們將生物素化的納米盤作為FACS探針，先在補(bǔ)償珠和工程化Ramos細(xì)胞上驗(yàn)證了特異性，無明顯背景結(jié)合。在人源化小鼠的HIV疫苗免疫實(shí)驗(yàn)中，成功分選到抗原特異性記憶B細(xì)胞，比例較初始B細(xì)胞提升約4.7倍；在恒河猴模型中，納米盤探針與傳統(tǒng)可溶性蛋白探針的分選效果相當(dāng)，還能識別針對跨膜蛋白特有表位的B細(xì)胞，為疫苗免疫應(yīng)答研究提供了新工具。

五、冷凍電鏡解析：3.5?分辨率解鎖抗體結(jié)合新細(xì)節(jié)

冷凍電鏡（cryo-EM）結(jié)構(gòu)解析是結(jié)構(gòu)導(dǎo)向疫苗設(shè)計的核心，我們利用納米盤平臺解析了Env gp151 MPER ND與3種廣譜中和抗體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，最高分辨率達(dá)3.5?。首次發(fā)現(xiàn)10E8的重鏈框架區(qū)3（HFR3）在gp120-gp41界面存在結(jié)合口袋，還觀察到10E8結(jié)合會引發(fā)MPER螺旋的動態(tài)重構(gòu)，這些細(xì)節(jié)在傳統(tǒng)肽段-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)中完全無法捕捉。通過偽病毒中和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該結(jié)構(gòu)中識別的關(guān)鍵殘基突變，會顯著影響10E8的中和活性，為HIV MPER靶向疫苗的工程化改造提供了精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)模板。

六、平臺價值：下一代疫苗研發(fā)的通用加速器

這款病毒糖蛋白納米盤平臺的最大優(yōu)勢，是還原了跨膜糖蛋白的天然脂質(zhì)環(huán)境和完整構(gòu)象，讓SPR、FACS、冷凍電鏡這些核心技術(shù)能直接應(yīng)用于天然狀態(tài)的跨膜抗原研究。從HIV到埃博拉的應(yīng)用驗(yàn)證，證明了其通用性；標(biāo)準(zhǔn)化的組裝流程和穩(wěn)定的產(chǎn)物，也讓其能適配疫苗研發(fā)的迭代設(shè)計需求。除了疫苗研發(fā)，該平臺還能拓展到膜蛋白的小分子篩選、抗體發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域，為膜蛋白相關(guān)的生物醫(yī)學(xué)研究提供了全新的技術(shù)支撐。

目前這款平臺已經(jīng)在HIV疫苗的工程化改造中展現(xiàn)出實(shí)際價值，后續(xù)針對其他包膜病毒的應(yīng)用還在持續(xù)推進(jìn)。相信隨著技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，納米盤會成為跨膜抗原研究的常規(guī)工具，讓疫苗研發(fā)從“經(jīng)驗(yàn)摸索”向“理性設(shè)計”的轉(zhuǎn)變更高效、更精準(zhǔn)。

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