所有臨床級(jí)CAR-T細(xì)胞均在現(xiàn)行藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（cGMP）條件下，經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制（QC）檢測(cè)后制造和放行。迄今為止，生產(chǎn)主要在集中化設(shè)施中進(jìn)行（如市場(chǎng)授權(quán)產(chǎn)品），但在去中心化的護(hù)理點(diǎn)（PoC）設(shè)施（針對(duì)多種研究性產(chǎn)品）進(jìn)行生產(chǎn)也逐漸興起。在后一種模式下，制造位于臨床中心，以便于及時(shí)給藥和提高物流效率。

盡管個(gè)體化CAR-T產(chǎn)品的制造流程存在產(chǎn)品特異性差異，但其總體工作流程是統(tǒng)一的。作為起始材料，根據(jù)人類來源物質(zhì)（SoHO）法規(guī)，獲取新鮮或冷凍保存的白細(xì)胞分離產(chǎn)物。隨后所有對(duì)分離產(chǎn)物的操作必須在符合GMP的環(huán)境中進(jìn)行，這是先進(jìn)治療醫(yī)藥產(chǎn)品（ATMP）法規(guī)的要求。這包括在適用時(shí)，分離和純化T細(xì)胞（例如CD3+、CD4+和/或CD8+亞群），作為制造過程中的中間產(chǎn)物。

此中間材料也可進(jìn)行冷凍保存或作為新鮮材料用于后續(xù)制造步驟，這些步驟通常包括T細(xì)胞激活、轉(zhuǎn)導(dǎo)和擴(kuò)增。對(duì)于激活，通常通過多效性細(xì)胞因子（主要是IL-2、IL-7和/或IL-15）結(jié)合可溶性抗體或抗體包被微珠提供的抗CD3/CD28刺激來刺激T細(xì)胞。為了利用CAR對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行基因修飾，可以使用病毒平臺(tái)（例如慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒）或非病毒平臺(tái)（例如轉(zhuǎn)座子）。

此外，在某些情況下，會(huì)實(shí)施基因編輯，例如降低耗竭標(biāo)志物或同種異體反應(yīng)性抗原的表達(dá)。然后，修飾后的T細(xì)胞被擴(kuò)增至達(dá)到所需劑量，通常需要5至14天，盡管某些新方法可將培養(yǎng)期限制在短短幾個(gè)小時(shí)（24-48小時(shí)）。

在整個(gè)制造過程中，會(huì)進(jìn)行各種過程控制（IPC）和QC測(cè)試，以確保最終藥物產(chǎn)品（DP）的純度、安全性和效力（表1）。DP可以以新鮮或冷凍保存的制劑形式給予患者。冷凍保存的DP具有較長(zhǎng)的保質(zhì)期（以年計(jì)），為完成放行所需的QC檢測(cè)以及管理患者最佳治療窗口提供了更大的靈活性。

新鮮CAR-T細(xì)胞DP通常必須在制造完成后1-2天內(nèi)給予患者，這對(duì)在輸注前及時(shí)完成所有QC檢測(cè)提出了挑戰(zhàn)。這對(duì)于無菌檢測(cè)尤其相關(guān)，因?yàn)楦鶕?jù)藥典標(biāo)準(zhǔn)，無菌檢測(cè)需要至少七天的培養(yǎng)期。為了解決這一限制，新鮮CAR-T細(xì)胞輸注通常采用兩步放行策略。這包括初步有條件放行證書，允許基于短時(shí)間內(nèi)可獲得的關(guān)鍵QC參數(shù)進(jìn)行輸注，隨后在所有強(qiáng)制性檢測(cè)（包括生物安全性檢測(cè)）完成后，簽發(fā)最終放行證書。

表1.在不同CAR-T細(xì)胞制造步驟中執(zhí)行的IPC和放行QC檢測(cè)

IPC與QC檢測(cè)

為確保純度、有效性、安全性和批次一致性，CAR-T細(xì)胞DP需經(jīng)過嚴(yán)格的QC檢測(cè)。CAR-T細(xì)胞DP的質(zhì)量不僅在最終收獲和制劑后為產(chǎn)品放行進(jìn)行評(píng)估，也在整個(gè)制造過程中的關(guān)鍵步驟進(jìn)行評(píng)估。此類IPC檢測(cè)對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)和潛在糾正偏差至關(guān)重要，從而最大限度地降低風(fēng)險(xiǎn)并確保最終DP符合預(yù)定的質(zhì)量屬性。必要的IPC檢測(cè)包括但不限于：在離體培養(yǎng)開始時(shí)和T細(xì)胞分選后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析確定細(xì)胞活力、T細(xì)胞純度和細(xì)胞計(jì)數(shù)。此外，在T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟后幾天，會(huì)測(cè)定CAR-T細(xì)胞的百分比（表1）。

關(guān)于QC放行檢測(cè)，這些檢測(cè)通常在最終DP上進(jìn)行。然而，如果提供了適當(dāng)?shù)睦碛桑判袡z測(cè)可以在更早的階段對(duì)藥物物質(zhì)進(jìn)行。對(duì)于所有DP的QC放行檢測(cè)（表2），需要定義合理設(shè)定的可接受標(biāo)準(zhǔn)，以確保安全性、質(zhì)量與一致性。

根據(jù)藥典指南，每個(gè)CAR-T細(xì)胞批次必須進(jìn)行含量（細(xì)胞組成）、鑒別（CAR表達(dá)）和純度（（CAR）T細(xì)胞百分比）檢測(cè)。此外，必須進(jìn)行無菌性、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)以確保產(chǎn)品安全。在產(chǎn)品開發(fā)過程中，需要對(duì)藥物產(chǎn)品的生物活性進(jìn)行進(jìn)一步表征，以建立相關(guān)的效價(jià)測(cè)定方法。該測(cè)定應(yīng)反映CAR-T細(xì)胞的作用機(jī)制（MoA），即抗原特異性觸發(fā)CAR后T細(xì)胞的激活。由于可接受標(biāo)準(zhǔn)通常基于臨床評(píng)估開始時(shí)有限的DP生產(chǎn)批次，其性質(zhì)本質(zhì)上是初步的，應(yīng)在進(jìn)一步開發(fā)過程中審查和調(diào)整。

在特定情況下，例如自體新鮮CAR-T產(chǎn)品，完整的放行檢測(cè)可能在患者給藥前無法完成。在此類情況下，必須實(shí)施基于風(fēng)險(xiǎn)的方法，以證明在輸注前使用一組更為有限的可用檢測(cè)結(jié)果是合理的，完整的QC檢測(cè)結(jié)果在治療后獲得。雖然合格方法在早期開發(fā)階段是可接受的，但到II期結(jié)束時(shí)以及注冊(cè)試驗(yàn)階段需要完全驗(yàn)證的分析方法（圖1）。這一要求與確保產(chǎn)品可比性的需求密切相關(guān)，例如在不同制造場(chǎng)地之間。這不僅對(duì)于證明授權(quán)CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品全球供應(yīng)的一致性至關(guān)重要，而且在為PoC策略啟動(dòng)多個(gè)制造中心的情況下也相關(guān)。由于起始材料、設(shè)備和操作人員專業(yè)知識(shí)的差異很大——這些因素都可能影響產(chǎn)品質(zhì)量屬性和批次間一致性——實(shí)施可比性研究面臨著重大挑戰(zhàn)。

表2.QC放行檢測(cè)總結(jié)及對(duì)應(yīng)的歐洲藥典（EP）章節(jié)和歐盟指南，這些是分析方法開發(fā)所必需的

圖1.CAR-T細(xì)胞DP從早期開發(fā)到市場(chǎng)授權(quán)所需的方法驗(yàn)證要求

效價(jià)測(cè)定

如上所述，CAR-T細(xì)胞DP的放行嚴(yán)格依賴于對(duì)特定定性和/或定量特性的評(píng)估，這些特性被稱為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），并參照預(yù)定的可接受標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估。其中，效價(jià)是一個(gè)關(guān)鍵屬性，根據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）的指南，必須作為每個(gè)CAR-T細(xì)胞批次放行所需的QC檢測(cè)的一部分進(jìn)行評(píng)估。

根據(jù)ICH Q6B，效價(jià)被定義為對(duì)DP生物活性的度量，通過與其相關(guān)生物學(xué)特性及產(chǎn)品所聲稱的MoA相關(guān)聯(lián)的定量測(cè)定進(jìn)行評(píng)估。值得注意的是，并不要求開發(fā)與患者預(yù)后具有預(yù)測(cè)相關(guān)性的測(cè)定方法。因此，效價(jià)應(yīng)僅被視為一個(gè)放行規(guī)格。在CAR-T細(xì)胞的背景下，效價(jià)測(cè)定旨在測(cè)試CAR-T細(xì)胞批次識(shí)別和消除腫瘤細(xì)胞的功能質(zhì)量，例如通過測(cè)量與表達(dá)靶抗原的腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞因子的釋放（主要是IFN-γ）、T細(xì)胞增殖或抗腫瘤細(xì)胞毒性。

CAR-T細(xì)胞MoA的高度復(fù)雜性和錯(cuò)綜性使得難以定義一種能夠完全代表其潛在生物活性的單一測(cè)定方法。事實(shí)上，F(xiàn)DA和EMA建議在初始臨床階段盡早建立多種潛在的效價(jià)測(cè)定方法，以便最終確定并驗(yàn)證用于關(guān)鍵試驗(yàn)的最佳效價(jià)測(cè)試。此外，F(xiàn)DA建議在產(chǎn)品放行時(shí)使用多種測(cè)定（即所謂的矩陣測(cè)定方法）來測(cè)量效價(jià)的不同方面，包括（1）細(xì)胞活力，（2）載體轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，（3）CAR表達(dá)，（4）細(xì)胞毒性和（5）細(xì)胞因子產(chǎn)生。

盡管每種效價(jià)測(cè)定都有其特定的特點(diǎn)，但目前尚無一種適用于所有不同CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品的通用解決方案，能夠支持在所有情況下優(yōu)先選擇某一種方法。最佳測(cè)定方法的識(shí)別與開發(fā)需要應(yīng)對(duì)幾個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)，包括：1）放行檢測(cè)的時(shí)間限制（例如，對(duì)于新鮮DP），2）可用于測(cè)試的實(shí)驗(yàn)材料有限（例如，制造時(shí)間非常短的CAR-T制造），3）商業(yè)化的全球可用參考標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)照品有限，4）不同中心之間的差異性。最后，效價(jià)測(cè)定代表了一項(xiàng)CQA，它作為病毒載體鑒定、DP穩(wěn)定性評(píng)估以及制造中心間可比性研究的基礎(chǔ)——無論是遵循集中式還是分散式生產(chǎn)模式。

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