生物系統(tǒng)的內(nèi)在復(fù)雜性與異質(zhì)性，使得解析生命基本原理日益依賴于能夠提供廉價、高精度單細(xì)胞與單分子分析的工具與方法。盡管已有多種平臺技術(shù)可用于單細(xì)胞基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組分析，但現(xiàn)有方法存在顯著局限。例如，基于液滴微流控的高通量方法通常局限于“一鍋法”反應(yīng)，無法在過程中更換試劑；而微孔板雖靈活，卻通量有限、體積大、操作繁瑣。理想方案需兼具液滴微流控的通量優(yōu)勢與微孔板平臺的靈活性。

近日，立陶宛維爾紐斯大學(xué)Linas Mazutis教授課題組提出了一種基于半透膜膠囊的通用型高通量單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)。該技術(shù)利用半透膜膠囊，可靈活應(yīng)用于多種高通量核酸分析，包括單細(xì)胞基因組與mRNA測序，以及基于特定核酸標(biāo)記、通過熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)分離單個轉(zhuǎn)錄組。SPCs具有良好的生物相容性，支持單細(xì)胞的長期培養(yǎng)與克隆擴(kuò)增，從而克服了液滴微流控平臺的一個根本性限制?？傮w而言，SPCs為基于多步生化反應(yīng)的、易于使用且可擴(kuò)展的單細(xì)胞組學(xué)應(yīng)用提供了一個可定制的通用工具。相關(guān)論文以“High-throughput single cell omics using semipermeable capsules”為題，發(fā)表在

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半透膜膠囊是由多孔薄殼包裹的微型液體腔室。研究人員利用微流控技術(shù)與由高分子量葡聚糖和甲基丙烯酰化明膠組成的水性兩相系統(tǒng)生成SPCs。通過調(diào)整微流控設(shè)備流速和GelMA濃度，可精確調(diào)控膠囊尺寸（35-260微米）與殼層厚度。SPCs具有出色的機(jī)械穩(wěn)定性，可耐受常規(guī)實(shí)驗(yàn)室操作。其關(guān)鍵特性在于能夠完全保留大于300 bp的核酸片段，同時允許小于約200 kDa的蛋白質(zhì)和試劑自由擴(kuò)散，這為在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室試管中進(jìn)行復(fù)雜的多步核酸分析（如單DNA分子數(shù)字PCR、單細(xì)胞RT-PCR、單基因組擴(kuò)增和全基因組測序）提供了可能，同時保持了單細(xì)胞或單分子分辨率。

圖1. 半透膜膠囊的生成與特性。 (A) SPCs概念圖：類似于透析膜的薄半透殼包裹的微觀液滴，殼層允許試劑、寡核苷酸和酶通過，但能有效保留長核酸分子。(B) 利用微流控和ATPS生成SPCs。相分離后，GelMA形成外殼，經(jīng)冷卻（物理交聯(lián)）和光聚合（化學(xué)交聯(lián)）固化。(C) 熒光標(biāo)記明膠制備的SPC共聚焦圖像，綠色顯示包裹液體核的薄外層。(D) 懸浮于PBS中并攜帶單個細(xì)胞的SPC明場圖像。(E) SPC在22°C下4小時內(nèi)對核酸片段的大小依賴性保留。(F) SPC在22°C下對不同分子量生物分子（0.33 kDa熒光素，20 kDa FITC-葡聚糖，66 kDa BSA，160 kDa FITC-IgG）的滲透性。(G) SPC與0.1 μM FITC-BSA在22°C孵育3分鐘后的熒光圖像。(H) SPC與0.2 μM FITC-葡聚糖在22°C孵育60分鐘后的熒光圖像。比例尺：20 μm。

圖2. 使用SPCs進(jìn)行核酸分析的應(yīng)用示例。 (A) 對封裝在SPCs中的細(xì)胞進(jìn)行核酸分析的概念圖。(B) 通過數(shù)字膠囊PCR進(jìn)行單DNA分子擴(kuò)增與分析（SYBR Green I染色）。(C) 靶向CD45、YAP和ACTB轉(zhuǎn)錄本的多重單細(xì)胞RT-PCR。(D) 通過phi29 DNA聚合酶對K-562細(xì)胞進(jìn)行單基因組擴(kuò)增，SYTO染料染色（黃色）。(E) 267個測序細(xì)胞中隨機(jī)選取的5個人類淋巴母細(xì)胞單細(xì)胞全基因組測序圈圖。比例尺：50 μm。

除了核酸分析，SPCs還支持細(xì)胞的長期生長，克服了液滴微流控的主要限制。如圖3所示，無論是懸浮細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞，均可在SPCs內(nèi)進(jìn)行長達(dá)數(shù)天至數(shù)周的培養(yǎng)，形成單細(xì)胞衍生的球狀體。膠囊的彈性外殼可隨細(xì)胞增殖而膨脹超過兩倍而不破裂。通過膠原酶溫和處理，可快速分解蛋白質(zhì)外殼，釋放出完整的細(xì)胞球體，且不影響細(xì)胞活性。 包被細(xì)胞還可被冷凍保存，后續(xù)仍能有效擴(kuò)增為球體。

圖3. 使用SPCs形成單細(xì)胞衍生球體。 (A) 將封裝細(xì)胞擴(kuò)增為球體的通用策略示意圖。(B) SPCs支持懸浮細(xì)胞（上排）和貼壁細(xì)胞（下排）的長期培養(yǎng)。(C) 通過添加膠原酶[E]釋放封閉在SPCs中的球體。(D) 培養(yǎng)1周后，使用活/死染色評估封閉在SPCs中的HCT116球體細(xì)胞活力（N = 155）。(E) 不同細(xì)胞系在5至14天內(nèi)形成的單細(xì)胞衍生球體。(F) A549細(xì)胞冷凍保存后的球體形成。(G) A549細(xì)胞冷凍保存前后的活力。比例尺：50 μm。

作為SPCs的一項(xiàng)重要應(yīng)用，研究人員開發(fā)了名為CapSeq（基于膠囊的RNA測序）的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法。該方法通過拆分-合并條形碼策略，可實(shí)現(xiàn)一次運(yùn)行中對超過10萬個單細(xì)胞進(jìn)行條形碼標(biāo)記。CapSeq優(yōu)化了逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與條形碼步驟，在測試中平均每個細(xì)胞可檢測到超過10,000個轉(zhuǎn)錄本和3,000個基因。特別值得注意的是，CapSeq采用嚴(yán)苛裂解條件，成功捕獲了傳統(tǒng)方法難以回收的中性粒細(xì)胞等脆弱細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)錄本回收率提高了3倍以上，展現(xiàn)出對敏感細(xì)胞類型極高的檢測靈敏度。

圖4. CapSeq用于高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)。 (A) CapSeq工作流程：裂解、純化、組合條形碼標(biāo)記、文庫制備、測序。(B) CapSeq在K-562細(xì)胞系上的性能（UMI/細(xì)胞）。(C) 在不同裂解條件下，健康供體白細(xì)胞中中性粒細(xì)胞回收率的箱線圖。(D) CapSeq與已發(fā)表方法在中性粒細(xì)胞基因捕獲數(shù)量上的比較。

研究人員利用CapSeq對急性髓系白血病患者的白細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了包含86,447個轉(zhuǎn)錄組的綜合細(xì)胞圖譜。分析揭示了AML患者中不同的白血病細(xì)胞表型，這些表型在不同患者間共享，并與臨床風(fēng)險分類相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，AML患者的成熟先天免疫細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）表現(xiàn)出功能失調(diào)和類干細(xì)胞的異常狀態(tài)，共享一組通常與白血病祖細(xì)胞/干細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的基因（如IGF2BP2, FLT3, MEIS1）的上調(diào)，表明這些成熟細(xì)胞可能處于功能改變的狀態(tài)。

圖5. 使用CapSeq對造血疾病進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。 (A) AML、中性粒細(xì)胞減少癥、G-CSF治療及健康個體白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組UMAP圖，按注釋細(xì)胞表型著色。(B) 白血病區(qū)室的力導(dǎo)向圖布局。(C) Hallmark通路的基因集富集分析。(D) 比較AML患者與健康供體時，先天免疫細(xì)胞類型間共享差異表達(dá)基因的UpSet圖。(E) AML患者與健康供體髓系細(xì)胞中所有顯著差異表達(dá)基因的火山圖。

為了展示SPC技術(shù)超越常規(guī)scRNA-seq應(yīng)用的廣泛用途，研究團(tuán)隊將CapSeq與單細(xì)胞RNA細(xì)胞計數(shù)術(shù)相結(jié)合，開發(fā)了一種基于RNA標(biāo)記表達(dá)來富集并測序單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的通用策略。以在AML中上調(diào)的lncRNA MIR181A1HG為例，研究人員對封裝后的細(xì)胞進(jìn)行靶向熒光PCR，隨后利用FACS分選熒光陽性膠囊。測序結(jié)果證實(shí)，該方法能有效富集MIR181A1HG陽性的白血病原始細(xì)胞，展示了SPC技術(shù)在基于缺乏合適抗體的核酸標(biāo)記進(jìn)行表型分選與測序方面的潛力。

圖6. 基于靶向核酸標(biāo)記通過FACS富集單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。 (A) AML細(xì)胞與所有其他細(xì)胞相比，前100個差異表達(dá)基因的基因生物型分布。(B) 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組UMAP圖，按MIR181A1HG、LNCAROD和LINC02147表達(dá)著色。(C) AML細(xì)胞與所有其他細(xì)胞相比的差異表達(dá)基因，按差異表達(dá)和統(tǒng)計學(xué)顯著性的綜合評分排序。(D) 基于目標(biāo)核酸標(biāo)記分選和測序單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的實(shí)驗(yàn)策略。(E) 四位AML患者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在基于MIR181A1HG表達(dá)分選前（左）和分選后（右）的UMAP圖，按細(xì)胞類型著色。(F) 基于MIR181A1HG表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分選后，陽性與陰性組分間細(xì)胞類型的差異豐度分析。

綜上所述，這項(xiàng)研究提出了一種基于半透膜膠囊的、廣泛適用的高通量單細(xì)胞組學(xué)研究平臺。該技術(shù)利用微流控高通量封裝單細(xì)胞，但后續(xù)所有步驟均可脫離微流控設(shè)備，使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室移液器和試管完成，易于采納和實(shí)施。SPCs兼具水凝膠珠的溶劑交換便利性，又避免了核酸在聚合物網(wǎng)格中的物理截留問題，使核酸在液態(tài)核內(nèi)自由分散，大幅提升了捕獲效率。其優(yōu)異的生物相容性支持長期細(xì)胞培養(yǎng)與克隆擴(kuò)增，并通過酶解釋放實(shí)現(xiàn)細(xì)胞回收。此外，基于RNA標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄組分選策略為稀有細(xì)胞狀態(tài)研究提供了新途徑。與現(xiàn)有液滴或微孔板方法相比，SPC技術(shù)提供了更大的靈活性、可擴(kuò)展性和易用性，確立了其作為下一代單細(xì)胞多組學(xué)研究的通用平臺地位。