Nuclear Factor I（NFI）蛋白家族是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在哺乳動(dòng)物中通常包含NFIA、NFIB、NFIC和NFIX四個(gè)成員，參與調(diào)控多種器官的發(fā)育與功能。其中，NFIA、NFIB和NFIX在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與放射狀膠質(zhì)細(xì)胞成熟、神經(jīng)發(fā)生及大腦形態(tài)發(fā)生等關(guān)鍵發(fā)育過程。近年來，研究者已在神經(jīng)發(fā)育障礙患者中鑒定出多種NFI基因變異，提示該蛋白家族與神經(jīng)發(fā)育疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而這些變異如何導(dǎo)致疾病的分子機(jī)制一直未被闡明。由于缺乏高分辨率的NFI-DNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)，疾病相關(guān)突變?nèi)绾斡绊慛FI蛋白的DNA識(shí)別及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，一直難以得到解析，這也制約了針對(duì)相關(guān)疾病的精準(zhǔn)診療策略的研發(fā)。

近日， 華中師范大學(xué)劉珂/閔金榮團(tuán)隊(duì) 在ActaBiochimica etBiophysicaSinica在線發(fā)表了題為Biochemical and structural studies of NFIA and NFIC reveal a conserved mechanism for specific DNA recognition and provide insight into potential pathogenicity of disease-associated mutations的研究論文。該研究通過解析NFIA和NFIC與DNA的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，在分子層面揭示了NFI蛋白二聚化及其特異性識(shí)別DNA的機(jī)制，并系統(tǒng)評(píng)估了疾病相關(guān)突變對(duì)DNA結(jié)合能力的影響。上述發(fā)現(xiàn)為理解神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)NFI突變的致病機(jī)理提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

NFI 蛋白由 N 端 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ DBD ）和 C 端轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域（ TRD ）組成。既往研究提示其 N 端約 240 個(gè)氨基酸殘基是形成二聚體的關(guān)鍵區(qū)域。為驗(yàn)證并深入探索這一機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)表達(dá)純化了 NFIA 和 NFIC 的一系列截短片段，并通過尺寸排阻色譜（ SEC ）分析其聚集狀態(tài)。結(jié)果顯示，較短的 NFIA （ aa 10–174 ）和 NFIC （ aa 10–175 ）片段主要以單體形式存在，而含有更多 C 端序列的 NFIA （ aa 10–205 、 10–221 ）與 NFIC （ aa 10–202 ） 則主要形成二聚體。這些結(jié)果表明， NFIA 和 NFIC 的 aa 175-200 區(qū)域是介導(dǎo)它們形成穩(wěn)定二聚體的關(guān)鍵片 段 。

為闡明 NFI 蛋白特異性識(shí)別 DNA 的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)合成了具有二分對(duì)稱性的雙鏈 DNA （正義鏈序列： 5’-AAGT TGGCA CCG TGCCA ACTT-3’ ，命名為 N3 DNA ）。 ITC 結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明， NFIA 與 NFIC 的同源二聚體對(duì) N3 DNA 表現(xiàn)出相近的親和力。隨后通過共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，成功解析了 NFIC 二聚體與 DNA 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，以及 NFIA 和 NFIC 單體分別結(jié)合 DNA 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析顯示，在 NFIC 二聚體中，兩個(gè)蛋白單體通過位于其 C 端的一段 α 螺旋實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定二聚化，而每個(gè)單體的 DBD 則以高度保守的構(gòu)象識(shí)別 TGGCA 和 TGCCA 半位點(diǎn)。盡管單體形式的 NFI 蛋白缺乏二聚化區(qū)域，但其與 DNA 的結(jié)合模式與二聚體中的單體亞基高度一 致 。

結(jié)構(gòu)分析表明， NFIC 二聚體通過氫鍵和疏水相互作用維持穩(wěn)定，且氨基酸序列分析顯示該家族的二聚化區(qū)域高度保守。 ITC 實(shí)驗(yàn)表明， NFIC 和 NFIA 的單體與二聚體在結(jié)合完整 N3 DNA 時(shí)表現(xiàn)出相近的親和力，但當(dāng) DNA 的一個(gè)識(shí)別半位點(diǎn)發(fā)生突變時(shí)，二聚體的結(jié)合親和力減弱。進(jìn)一步綜合 DNA 結(jié)合實(shí)驗(yàn)與復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析表明， NFIC 二聚體的兩個(gè)單體結(jié)合于 DNA 雙鏈的同一側(cè)。該二聚化構(gòu)象對(duì)兩個(gè)識(shí)別半位點(diǎn)之間的空間間距形成結(jié)構(gòu)約束，因此改變半位點(diǎn)間的核苷酸長(zhǎng)度會(huì)顯著削弱 NFI 二聚體的結(jié)合親和力，而改變間隔區(qū)核苷酸組成對(duì)其親和力影響較小。這些結(jié)果表明，二聚化增強(qiáng)了 NFI 蛋白對(duì)完整二分對(duì)稱 N3 DNA 的特異性結(jié)合 。

NFIC 二聚體與 N3 DNA 的復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示，兩個(gè)蛋白單體的 DBD 從相反方向通過各自的 DNA 結(jié)合環(huán)（ loop1 ）嵌入 DNA 大溝，特異性識(shí)別 N3 DNA 的兩個(gè)半位點(diǎn)。具體而言，第一個(gè)單體通過其 loop1 上的氨基酸殘基 R117 、 A124 和 K126 識(shí)別第一個(gè) TGGCA 位點(diǎn)，而第二個(gè)單體采用高度相似的結(jié)合模式識(shí)別 TGCCA 半位點(diǎn)。氨基酸序列與復(fù)合物結(jié)構(gòu)比對(duì)表明，該識(shí)別機(jī)制在 NFI 蛋白家族中高度保守 。

遺傳學(xué)分析顯示，臨床鑒定的神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān) NFI 突變大多位于其保守的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域。為解析這些突變的致病機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)選取了在 NFIA 、 NFIB 和 NFIX 中均被報(bào)道的對(duì)應(yīng)位點(diǎn)，在 NFIA 蛋白中引入定點(diǎn)突變，并評(píng)估了其對(duì) DNA 結(jié)合能力的影響。 ITC 結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在檢測(cè)的疾病相關(guān)突變中， R116G 、 K125E 和 D118H 突變均顯著降低了蛋白與 DNA 的結(jié)合能力。進(jìn)一步的復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析表明，這些突變主要通過直接破壞與 DNA 堿基的相互作用，或改變 DNA 結(jié)合環(huán)的局部構(gòu)象，從而損害了 NFIA 的 DNA 結(jié)合功 能 。

通過對(duì) NFIA 和 NFIC 聚集狀態(tài)及其 DNA 復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析，本研究從分子層面揭示了 NFI 家族通過保守二聚化界面組裝，并特異性識(shí)別二分對(duì)稱 TGGCA(N3)TGCCA DNA 序列的機(jī)制。研究進(jìn)一步通過結(jié)構(gòu)與結(jié)合實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān) NFI 突變對(duì)其 DNA 結(jié)合能力的影響，為已知患者變異提供了機(jī)制性功能注釋。這些發(fā)現(xiàn)不僅拓展了對(duì) NFI 蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的理解，也為相關(guān)疾病的機(jī)制研究與精準(zhǔn)診療策略的開發(fā)奠定了關(guān)鍵的理論基礎(chǔ) 。

原文鏈接：https://www.sciengine.com/ABBS/doi/10.3724/abbs.2025236

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