神經(jīng)干細胞（NSCs）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的 “種子細胞”，具備自我更新與多向分化潛能（可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞），在神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ。?、神經(jīng)損傷及神經(jīng)精神疾?。ㄈ缫钟舭Y）的細胞治療中具有不可替代的價值。人多能干細胞（hPSC，包括胚胎干細胞 ESC 和誘導(dǎo)多能干細胞 iPSC）可分化為 NSCs，為臨床應(yīng)用提供了無限的細胞來源。然而，當前 hPSC 向 NSCs 誘導(dǎo)的臨床轉(zhuǎn)化仍面臨三大核心瓶頸：① 傳統(tǒng)方案依賴病毒載體、復(fù)雜轉(zhuǎn)錄因子或 undefined 培養(yǎng)基，存在成瘤風險、操作繁瑣且重復(fù)性差；② 誘導(dǎo)的 NSCs 神經(jīng)譜系定向分化潛能不足，均一性低，難以滿足臨床治療的功能需求；③ 分化機制尚未完全闡明，尤其是表觀遺傳調(diào)控與代謝重編程在神經(jīng)命運決定中的協(xié)同作用仍不明確，制約了誘導(dǎo)體系的優(yōu)化。

為解決這些問題，研究人員嘗試通過小分子化合物調(diào)控細胞信號通路以優(yōu)化誘導(dǎo)效率。視黃酸（RA）信號與 Wnt 信號在胚胎神經(jīng)發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色，前者通過激活視黃酸受體（RAR）促進神經(jīng)分化，后者則調(diào)控神經(jīng)前體細胞的增殖與命運決定。TTNPB 作為強效 RAR 激動劑，已被證實參與細胞重編程與分化調(diào)控，而 CHIR99021 作為經(jīng)典 Wnt 信號激活劑，可誘導(dǎo) hPSC 向 NSCs 分化。但二者協(xié)同誘導(dǎo) hPSC 向 NSCs 分化的效果、核心機制，以及誘導(dǎo)細胞的體內(nèi)功能驗證，此前尚未有系統(tǒng)報道。

近日，內(nèi)蒙古大學陳楊林、包斯琴、吳智敏、李喜和團隊在國際期刊Advanced Science在線發(fā)表了一項突破性研究，題為TTNPB Promotes Human Pluripotent Stem Cell-to-Neural Stem Cell Transition via Modulation of Chromatin Accessibility and the S-(5'-adenosyl)-L-homocysteine/Choline Metabolic Network。該研究建立 “TTNPB+CHIR99021” 雙小分子協(xié)同誘導(dǎo)體系，在化學成分明確的 N2B27 培養(yǎng)基中，從hPSC高效分化出進階神經(jīng)干細胞（ANSCs），并通過轉(zhuǎn)錄組、ATAC-seq、代謝組學及體內(nèi)功能實驗，系統(tǒng)揭示了 “表觀遺傳重塑 - 代謝重編程” 協(xié)同驅(qū)動神經(jīng)分化的核心機制，且證實 ANSCs 在抑郁模型大鼠中具有顯著治療效果，為神經(jīng)疾病細胞治療提供了全新策略。

研究團隊首先優(yōu)化誘導(dǎo)體系：在 N2B27 化學成分明確培養(yǎng)基中，以 3μM CHIR99021（已驗證有效濃度）聯(lián)合不同濃度 TTNPB 處理 hPSC，發(fā)現(xiàn) 0.5μM TTNPB 即可顯著上調(diào)神經(jīng)外胚層基因（SOX2、PAX6、SOX1）表達，由此確定 “0.5μM TTNPB+3μM CHIR99021+N2B27” 為最優(yōu)誘導(dǎo)體系，誘導(dǎo)的細胞命名為 ANSCs。進一步驗證顯示，ANSCs 具有長期自我更新能力，傳代超過 50 代仍保持穩(wěn)定核型與堿性磷酸酶（AP）陽性，顯著優(yōu)于傳統(tǒng) NSCs；免疫熒光與 RNA-seq 證實，ANSCs 低表達多能基因（OCT4、NANOG），高表達神經(jīng)外胚層關(guān)鍵基因（PAX6、SOX1、NES、NEUROG2），自發(fā)分化 9 天后，神經(jīng)元標志物 TUBB3、膠質(zhì)細胞標志物 SOX10 表達量顯著高于傳統(tǒng) NSCs，且該體系在 H9 ESC、Z1 iPSC 等不同細胞系中均能穩(wěn)定誘導(dǎo) ANSCs，證實了體系的普適性。值得注意的是，單獨使用 TTNPB 雖能產(chǎn)生一定作用，但無法維持細胞存活與增殖，而 CHIR99021 的存在是 ANSCs 存活的必要條件 —— 去除 CHIR99021 后，僅 TTNPB 處理會導(dǎo)致細胞大量死亡，證實二者的協(xié)同作用不僅體現(xiàn)在誘導(dǎo)效率，更體現(xiàn)在細胞穩(wěn)態(tài)維持上。

為探究協(xié)同誘導(dǎo)的表觀遺傳機制，團隊對 hPSC、傳統(tǒng) NSCs 和 ANSCs 進行 ATAC-seq 分析，結(jié)果顯示 ANSCs 的全局染色質(zhì)可及性顯著高于 hPSC 和傳統(tǒng) NSCs，尤其是在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）±3kb 區(qū)域，表現(xiàn)出更強的信號富集。具體而言，神經(jīng)外胚層特異性基因（PAX6、SOX1、NEUROG2）的染色質(zhì)可及性顯著增強，而多能性基因（POU5F1、ZFP42）的可及性顯著降低，為神經(jīng)分化基因的轉(zhuǎn)錄激活提供了表觀遺傳基礎(chǔ)；轉(zhuǎn)錄因子活性分析顯示，ANSCs 中 PAX3/7、HOXB9 等神經(jīng)譜系轉(zhuǎn)錄因子活性升高，AP-1 復(fù)合體（JUNB、FOSL1）被激活，而 KLF 家族等多能性轉(zhuǎn)錄因子活性受抑制，形成特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；與傳統(tǒng) NSCs 相比，ANSCs 有 3758 個染色質(zhì)可及性峰上調(diào)，僅 363 個下調(diào)，且差異峰主要位于基因間區(qū)，提示 TTNPB 可能通過調(diào)控遠端調(diào)控元件增強 CHIR99021 的神經(jīng)誘導(dǎo)效應(yīng)。

非靶向代謝組學分析揭示了 ANSCs 的特異性代謝特征：與 hPSC 和傳統(tǒng) NSCs 相比，ANSCs 中 S - 腺苷同型半胱氨酸（SAH）、二磷酸腺苷（ADP）、谷胱甘肽（GSH）、L - 脯氨酸水平顯著升高，且這些代謝物與神經(jīng)外胚層基因表達呈強正相關(guān)。進一步功能驗證發(fā)現(xiàn)，外源性補充 SAH 可顯著上調(diào) NSCs 和 hPSC 中神經(jīng)標志物 NESTIN 的表達（NSCs 中提升 15 倍以上），并誘導(dǎo) hPSC 形成神經(jīng)球樣結(jié)構(gòu)；膽堿作為磷脂酰膽堿（PC）的代謝產(chǎn)物，補充后可劑量依賴性促進神經(jīng)分化，50μM 時效果最佳，且與神經(jīng)基因（NEUROG1、PAX6）表達正相關(guān)；機制上，TTNPB 通過激活 RA 信號，直接上調(diào)磷脂酰乙醇胺 N - 甲基轉(zhuǎn)移酶（PEMT）的表達（其啟動子區(qū)域染色質(zhì)可及性增強），促進磷脂酰乙醇胺（PE）向 PC 轉(zhuǎn)化，進而生成膽堿；同時，SAH 水解產(chǎn)生的同型半胱氨酸可促進 GSH 合成，形成 “TTNPB-PEMT-SAH / 膽堿” 核心代謝網(wǎng)絡(luò)，為神經(jīng)分化提供膜結(jié)構(gòu)原料與氧化還原平衡支持。

為驗證 ANSCs 的臨床應(yīng)用潛力，團隊構(gòu)建了慢性不可預(yù)測溫和應(yīng)激（CUMS）+ 脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的抑郁模型大鼠，將 tdTomato 標記的 ANSCs 或傳統(tǒng) NSCs 通過立體定向注射到大鼠海馬區(qū)。結(jié)果顯示，移植后 7 天，ANSCs 在大鼠海馬區(qū)成功定植并存活，且存活數(shù)量顯著多于傳統(tǒng) NSCs；行為學檢測證實，ANSCs 移植組大鼠體重下降幅度減小，蔗糖偏好率顯著提升，曠場試驗總移動距離、高架十字迷宮開臂停留時間均恢復(fù)至接近正常水平，抑郁樣行為得到顯著改善；分子機制上，移植后大鼠海馬區(qū)炎癥水平降低（脾指數(shù)下降），轉(zhuǎn)錄組特征向正常對照組靠攏，證實 ANSCs 可通過調(diào)節(jié)海馬微環(huán)境、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等方式發(fā)揮治療作用。

該研究首次建立了 “雙小分子協(xié)同 + 化學成分明確” 的 ANSCs 誘導(dǎo)體系，系統(tǒng)闡明了 TTNPB 與 CHIR99021 通過 “表觀遺傳重塑 - 代謝重編程” 協(xié)同驅(qū)動 hPSC 向神經(jīng)干細胞分化的核心機制：TTNPB 作為 “表觀遺傳調(diào)節(jié)劑”，增強神經(jīng)分化基因的染色質(zhì)可及性，放大 CHIR99021 的神經(jīng)誘導(dǎo)效應(yīng)；同時，二者協(xié)同激活 SAH / 膽堿代謝網(wǎng)絡(luò)，為神經(jīng)命運決定提供內(nèi)在能量與物質(zhì)支持。誘導(dǎo)的 ANSCs 不僅具備 “高效分化、長期增殖、安全無毒” 的技術(shù)優(yōu)勢，更在抑郁模型中展現(xiàn)出顯著治療效果，為神經(jīng)疾病的細胞治療提供了全新的種子細胞來源。此外，該研究還為細胞命運轉(zhuǎn)換的機制研究提供了新范式 —— 首次揭示 RA 信號在神經(jīng)分化中的 “表觀遺傳 - 代謝” 雙重調(diào)控作用，為后續(xù)小分子誘導(dǎo)體系的優(yōu)化提供了理論依據(jù)。未來，隨著該體系的進一步完善，有望在阿爾茨海默病、脊髓損傷等更多神經(jīng)疾病模型中開展驗證，加速干細胞療法的臨床轉(zhuǎn)化進程。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202515648

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