2025年12月5日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所鄭海學(xué)研究員團(tuán)隊(duì)在國(guó)際期刊mBio（IF=4.7）上發(fā)表研究論文“Quantitative proteomic analysis identifies the unfolded protein response as a host pathway co-opted by ASFV to promote replication”。該研究通過(guò)4D無(wú)標(biāo)簽定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，首次在豬體內(nèi)多器官水平描繪了ASFV感染的蛋白動(dòng)態(tài)景觀。研究揭示，ASFV通過(guò)激活宿主展開(kāi)未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response, UPR）途徑來(lái)促進(jìn)病毒復(fù)制，這一發(fā)現(xiàn)為理解病毒-宿主相互作用提供了新視角，并為潛在抗病毒策略奠定基礎(chǔ)。

研究采用4D無(wú)標(biāo)簽定量蛋白質(zhì)組學(xué)的高分辨率技術(shù)，通過(guò)增加離子遷移維度，提高對(duì)復(fù)雜樣本中低豐度蛋白的檢測(cè)精度。相比傳統(tǒng)3D方法，該技術(shù)能更準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的肽段，適用于多器官樣本分析。

對(duì)三個(gè)器官的樣本進(jìn)行蛋白提取和LC-MS/MS分析，鑒定出超過(guò)6000種蛋白。主成分分析和層次聚類顯示，生物重復(fù)間高度一致，不同器官間分離明顯。交叉分析發(fā)現(xiàn)，三個(gè)器官在所有時(shí)間點(diǎn)共有3882種核心蛋白。這些蛋白通過(guò)TCseq時(shí)間序列分析分為六個(gè)表達(dá)簇：如簇1涉及翻譯和核糖體結(jié)構(gòu)，感染后表達(dá)先升后降；簇4和5富集蛋白折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工，表達(dá)上調(diào)。

圖1 非洲豬瘟病毒感染后豬腎、脾淋巴結(jié)和脾臟的蛋白質(zhì)組學(xué)特征

進(jìn)一步，使用特異性度量識(shí)別器官和感染階段特異蛋白。以SPM >0.7為閾值，腎臟和脾臟在晚期感染（7 dpi）有更多特異蛋白，如脾臟的C反應(yīng)蛋白顯著上調(diào)，激活補(bǔ)體系統(tǒng)。差異表達(dá)蛋白分析顯示，脾臟DEPs最多（尤其是7 dpi），富集于ER蛋白加工、翻譯、蛋白折疊和先天免疫響應(yīng)。這些DEPs的蛋白-蛋白交互網(wǎng)絡(luò)揭示兩個(gè)模塊：蛋白折疊和先天免疫，由EIF2AK2（也稱PKR）連接。該激酶響應(yīng)雙鏈RNA，抑制翻譯，但ASFV可能通過(guò)產(chǎn)生dsRNA激活它，形成復(fù)雜調(diào)控。

圖2 組織特異性感染相關(guān)蛋白鑒定

基因集變異分析確認(rèn)，UPR和干擾素響應(yīng)在感染后激活。UPR是真核細(xì)胞應(yīng)對(duì)ER壓力的保守機(jī)制，包括PERK、IRE1和ATF6三條分支，幫助恢復(fù)ER穩(wěn)態(tài)或觸發(fā)凋亡。

圖3 DEPs的功能模塊失調(diào)

ASFV激活UPR的體內(nèi)外證據(jù)

研究的核心發(fā)現(xiàn)是ASFV激活所有三條UPR分支，促進(jìn)病毒復(fù)制。在體內(nèi)，5-7 dpi時(shí)，UPR標(biāo)志物HSPA5（也稱GRP78/BiP）在三個(gè)器官顯著上調(diào)。Western blot和qPCR驗(yàn)證顯示，PERK磷酸化、IRE1磷酸化、XBP1剪接（sXBP1）和ATF6裂解增加，下游基因如DDIT3（CHOP）、ATF4和DNAJC3表達(dá)升高。這表明ASFV誘導(dǎo)ER應(yīng)激，激活完整UPR響應(yīng)。

圖4 ASFV在體內(nèi)和體外激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)

體外實(shí)驗(yàn)在PAM細(xì)胞中證實(shí)相同模式：感染后HSPA5上調(diào)，三條分支激活，下游基因誘導(dǎo)。這些結(jié)果超越以往研究（如Galindo等報(bào)道的ATF6激活，或Zhong等PERK激活），首次證明ASFV在體內(nèi)和體外全面劫持UPR。

病毒蛋白D117L作為UPR激活的關(guān)鍵因子

為識(shí)別病毒調(diào)控因子，團(tuán)隊(duì)從22種檢測(cè)到的ASFV蛋白構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)D117L與UPR相關(guān)蛋白相關(guān)性最高。過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示，D117L強(qiáng)烈激活HSPA5和ATF6報(bào)告子，下游基因DDIT3、DNAJC3和DNAJB9轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。

圖5 D117L通過(guò)靶向關(guān)鍵的未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）組分，激活三條UPR通路

D117L含跨膜域（38-60氨基酸），突變體分析證實(shí)該域?qū)PR激活必需。質(zhì)譜鑒定D117L交互蛋白，包括HSPA5、CANX和PDIA4。免疫沉淀和免疫熒光確認(rèn)D117L與HSPA5和CANX結(jié)合，依賴跨膜域。CANX是ER伴侶，幫助蛋白折疊；HSPA5是UPR主調(diào)控者。D117L通過(guò)這些交互，直接激活三條UPR分支。

圖6 未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）的激活促進(jìn)ASFV的復(fù)制

功能驗(yàn)證顯示，抑制UPR（用4-PBA）或各分支（GSK2606414抑制PERK、4μ8C抑制IRE1、Ceapin-A7抑制ATF6）顯著降低病毒蛋白（p72、p54、p30）表達(dá)、mRNA轉(zhuǎn)錄和感染子代產(chǎn)量（TCID50測(cè)定）。siRNA敲減UPR傳感器也抑制復(fù)制，證實(shí)UPR對(duì)ASFV復(fù)制有利。

該研究為ASF防控提供靶點(diǎn)：設(shè)計(jì)抑制D117L-UPR交互的藥物，或UPR特異抑制劑，可能開(kāi)發(fā)新型抗病毒療法。團(tuán)隊(duì)建議擴(kuò)展到更多器官、豬種或病毒株，結(jié)合基因編輯驗(yàn)證機(jī)制。鑒于ASF全球流行，此類基礎(chǔ)研究有望加速疫苗和藥物開(kāi)發(fā)，緩解養(yǎng)豬業(yè)壓力。