CAR-T細胞的大規(guī)模生產(chǎn)工藝在過去十余年間基本保持穩(wěn)定。其核心流程是從患者外周血單核細胞（通過白細胞分離術獲取）中分離出T細胞，隨后在體外利用攜帶CAR基因的逆轉錄病毒或慢病毒載體對T細胞進行改造，再經(jīng)過體外擴增獲得足量細胞。在藥品生產(chǎn)層面，病毒載體被視為基因治療產(chǎn)品的起始物料。因此，必須對其生產(chǎn)過程和質量進行嚴格管控，以確保臨床試驗的安全與有效。

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CAR-T制造中常用的病毒載體

γ-逆轉錄病毒載體和慢病毒載體是目前自體CAR-T細胞制備中最常用的兩種病毒載體。兩者均屬于逆轉錄病毒科、具有包膜的RNA病毒，在生物學特性上有很多相似之處。但在實際選用時，仍需關注它們在生產(chǎn)和基因組整合方面的關鍵差異（見表1）。

表1 逆轉錄病毒載體與慢病毒載體的主要特點

兩種載體均能實現(xiàn)較高的轉導效率和長期穩(wěn)定的轉基因表達。轉導過程中，病毒RNA基因組經(jīng)逆轉錄后，以半隨機方式整合入宿主細胞基因組。盡管新一代載體采用“自失活”長末端重復序列（LTR）已顯著降低了插入突變風險，但該風險依然存在，且與載體設計密切相。

RV與LVV的生產(chǎn)方式類似：通常采用質粒瞬時轉染HEK293T或其衍生細胞（貼壁或懸浮培養(yǎng)），通過一組質粒（包括輔助質粒、包膜蛋白質粒和CAR表達質粒）共同產(chǎn)生僅能感染一輪、無復制能力、無致病性的重組病毒顆粒。雖然理論上可構建穩(wěn)定包裝細胞系，但LVV的穩(wěn)轉系構建難度高于RV。生產(chǎn)過程中，細胞向培養(yǎng)基中釋放大量直徑約100 nm、結構相對脆弱的包膜病毒顆粒，隨后需經(jīng)過快速的下游處理步驟進行濃縮、純化與冷凍。一般而言，LVV比RV更能耐受下游工藝的嚴苛條件。

? 二 ?

病毒載體的GMP生產(chǎn)

用于臨床試驗的病毒載體需在符合GMP規(guī)范下進行規(guī)?；a(chǎn)（通常收獲培養(yǎng)液體積不低于50升）。目前主流方式仍是通過質粒瞬時轉染HEK293T系細胞生產(chǎn)，轉染后48-72小時收獲病毒液。

貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)（如多層細胞工廠）已有十多年應用歷史，而新型固定床生物反應器則能提供更大表面積（可達500–600 m2，相當于1000升培養(yǎng)體積），且占地面積小，更適合一次性使用，易于符合GMP要求。懸浮培養(yǎng)則多采用攪拌罐生物反應器；為降低剪切力對病毒載體的影響，波浪式生物反應器 WAVE 更溫和方式也在不斷探索中。

采用穩(wěn)定生產(chǎn)細胞系可簡化流程、降低資源消耗，從而緩解大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸。穩(wěn)定系更易于實施灌流或再循環(huán)等工藝強化策略，實現(xiàn)高密度培養(yǎng)并獲得更高病毒滴度。但其缺點是對產(chǎn)品變更的靈活性不如瞬時轉染系統(tǒng)。

無論上游工藝如何，病毒顆粒均需從收獲的細胞培養(yǎng)液中回收，并經(jīng)過下游純化與濃縮步驟，一般包括（順序可調整）：深層過濾、核酸酶處理、切向流過濾/透析、離子交換色譜及無菌過濾。下游工藝的穩(wěn)健性很大程度上取決于載體包膜的選擇。VSV-G包膜因其耐受性強（可承受切向流過濾和色譜操作中的剪切力與鹽度變化），已成為工業(yè)化生產(chǎn)的首選。整個過程需在保持病毒活性與最大限度去除雜質之間取得平衡。純化后的載體需配制于適宜的保護劑中，于-70°C以下長期保存，且不影響后續(xù)對T細胞的轉導能力。

典型病毒載體生產(chǎn)工藝流程示意圖

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病毒載體批次的質量控制

病毒載體作為CAR-T細胞的起始物料，必須在GMP或類似GMP條件下生產(chǎn)。其批次放行檢測主要包括以下六大類指標：理化性質、數(shù)量、鑒別、安全性、純度和效力，具體檢測項目及方法見表2。

表2 病毒載體批次典型放行檢測項目

效力檢測在產(chǎn)品進入臨床后期及申報上市時尤為重要。此類檢測應定量化，并盡可能反映產(chǎn)品的作用機制，通常包括病毒感染性、轉基因RNA/蛋白表達水平及功能學實驗等多維度評估。

工藝相關雜質（如BSA、殘留質粒）的檢測需根據(jù)生產(chǎn)過程中是否使用相應試劑來決定。部分純度項目在理由充分的情況下，可不納入批放行檢測，僅作為產(chǎn)品表征研究。關鍵雜質（如宿主DNA、宿主蛋白）的接受限度應由申辦方基于風險評估來確定。

此外，建議對病毒載體進行進一步表征分析，例如病毒顆粒的“完整/空殼”比例分析或基因組整合位點譜分析。

總結與展望

目前，基于逆轉錄病毒或慢病毒載體的體外CAR-T細胞生產(chǎn)技術已支撐了多項臨床試驗和上市產(chǎn)品。展望未來，隨著新型載體在臨床前研究中展現(xiàn)出潛力，體內直接改造患者 T 細胞已經(jīng)成為更具吸引力的方向，從而規(guī)避體外制備帶來的諸多物流與成本挑戰(zhàn)。當然，用于體內的載體將作為最終的基因治療產(chǎn)品，對其安全性與效能的要求也將更為嚴苛。

參考文獻

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